Generatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn
Summary
We beschrijven een protocol voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn.
Abstract
Het verkennen van het therapeutisch potentieel van mesenchymale stamcellen is afhankelijk van het gemak van isolatie, de potentie voor differentiatie en de betrouwbaarheid en robuustheid van de bron. We beschrijven hier een stapsgewijs protocol voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel (uMSCs), hun immunofenotypering en de voortplanting van dergelijke culturen over verschillende passages. In deze procedure is de levensvatbaarheid van de uMSCs hoog omdat er geen enzymatische spijsvertering is. Verder zorgt het verwijderen van bloedvaten, inclusief de navelstrengslagaders en de ader, ervoor dat er geen besmetting is van cellen van endotheeloorsprong. Met behulp van flowcytometrie zijn uMSCs bij isolatie CD45−CD34−, wat wijst op een afwezigheid van cellen uit de hematopoietische afstamming. Belangrijk is dat ze belangrijke oppervlaktemarkeringen uitdrukken, CD105, CD90 en CD73. Bij het vaststellen van culturen beschrijft dit artikel een efficiënte methode om differentiatie in deze uMSCs in de skeletspierlijn te induceren. Een gedetailleerde analyse van myogene progressie in gedifferentieerde uMSCs onthult dat uMSCs Pax7 uitdrukken, een marker voor myogene voorlopers in de beginfase van differentiatie, gevolgd door de expressie van MyoD en Myf5, en ten slotte een terminale differentiatiemarker, myosine heavy chain (MyHC).
Introduction
De menselijke navelstreng is gecrediteerd om een robuust reservoir van mesenchymale stamcellen te bezitten, die momenteel worden onderzocht voor regeneratieve therapieën vanwege hun robuuste proliferatie- en differentiatiesnelheden, immunomodulerende eigenschappen en het vermogen om cellen te genereren uit alle drie de kiemlagen1. Het navelstrengweefsel bestaat uit meerdere compartimenten zoals het navelstrengbloed, het navelstrengsubendotheel en de Wharton’s jelly (WJ), die op zichzelf drie onduidelijke regio’s omvat- de perivasculaire zone, de intervasculaire zone en de subamnion of de koordvoering (CL)2. Hoewel uMSC’s kunnen worden geïsoleerd van al deze verschillende regio’s en in grote lijnen belangrijke MSC-markers kunnen uitdrukken, is er geen duidelijkheid over de vraag of deze compartimenten dezelfde populatie uMSC’s bevatten of verschillen vertonen in hun differentiatiepotenties3. Daarom vereisen protocollen voor de isolatie van uMSCs een grotere precisie in hun modus en regio van isolatie, de robuuste karakterisering van differentiatiepotentialen en ten slotte een vergelijkende analyse van verschillende compartimenten van het snoer.
In deze context hebben weinig studies verschillen aangetoond in uMSC proliferatieve en differentiatieve potentialen tussen verschillende delen van het koord. Hiervan onthulden vergelijkende analyses tussen uMSCs geïsoleerd van de CL- en WJ-regio’s een groter proliferatief potentieel in CL-afgeleide uMSCs 3,4. In een afzonderlijke studie presteerden WJ-afgeleide uMSCs beter in proliferatietests in vergelijking met perivasculaire cellen (HUCPV)5. Bij het onderzoeken van verschillen tussen van navelstrengbloed afgeleide uMSCs en van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs zonder vasculaire besmetting, werd differentiële expressie van belangrijke MSC-markers gemeld tussen de twee compartimenten, evenals verhoogde proliferatiesnelheden in van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs6.
Van de verschillende studies die de differentiatiemogelijkheden van uMSCs onderzoeken, voornamelijk in weefsels van de mesoderm-afstamming, zoals osteogene, adipogene en chondrogene afstammingslijnen, hebben er maar heel weinig gedetailleerde protocollen opgeleverd voor myogene differentiatie en daaropvolgende karakterisering, evenals vergelijkende analyses tussen verschillende koordcompartimenten. In deze context hebben we een robuust spierdifferentiatieprotocol ontwikkeld en waargenomen dat van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs superieure myogene differentiatiemogelijkheden vertonen in vergelijking met navelstrengbloed6. Hier wordt een stapsgewijs protocol beschreven voor de isolatie van uMSCs van het hele navelstrengweefsel zonder cellen geassocieerd met de vasculatuur, hun karakterisering en hun differentiatie in de myogene afstamming.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen
Een cruciale stap in dit protocol is het verzamelen van weefsel onder aseptische omstandigheden, vanaf het moment van levering tot het onderhoud van steriele culturen, voor de gehele duur van de vermeerdering. Tijdens het verzamelen van het snoer is het essentieel dat het snoer geen niet-gesteriliseerd oppervlak raakt en extern wordt afgeveegd met 70% ethanol voordat het wordt verzameld in buizen met PBS aangevuld met antibiotica. Het is belangrijk om de tijd tussen het verzamelen van…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken de heer Ojas Tikoo voor hun hulp bij het filmen en videoproductie. We erkennen ook de hulp die is ontvangen van het GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India) personeel, verpleegkundigen en senior onderzoeksfunctionarissen in het Gurugram Civil Hospital en Dr. Pallavi Kshetrapal voor hulp bij logistiek. Dit werk werd ondersteund door subsidies toegekend aan Suchitra Gopinath van het Department of Biotechnology, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton’s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton’s jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton’s jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
