Rose Bengal-Gemedieerde fotodynamische therapie om Candida albicans te remmen
Summary
De groeiende incidentie van resistente Candida albicans is wereldwijd een ernstig gezondheidsprobleem. Antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) kan een strategie bieden om resistente schimmelinfecties te bestrijden. Het huidige protocol beschrijft rose bengal-gemedieerde aPDT werkzaamheid op een multiresistente C. albicans stam in vitro.
Abstract
Invasieve Candida albicans-infectie is een belangrijke opportunistische schimmelinfectie bij de mens omdat het een van de meest voorkomende kolonisatoren van de darm, mond, vagina en huid is. Ondanks de beschikbaarheid van antischimmelmedicatie blijft het sterftecijfer van invasieve candidiasis ~ 50%. Helaas neemt de incidentie van resistente C. albicans wereldwijd toe. Antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) kan een alternatieve of adjuvante behandeling bieden om de vorming van C. albicans biofilm te remmen en resistentie tegen geneesmiddelen te overwinnen. Rose bengal (RB)-gemedieerde aPDT heeft aangetoond effectieve celdoding van bacteriën en C. albicans. In deze studie wordt de werkzaamheid van RB-aPDT op multiresistente C. albicans beschreven. Een zelfgemaakte groene lichtgevende diode (LED) lichtbron is ontworpen om uit te lijnen met het midden van een put van een 96-well plaat. De gisten werden geïncubeerd in de putten met verschillende concentraties RB en verlicht met verschillende fluences van groen licht. De dodende effecten werden geanalyseerd met behulp van de plaatverdunningsmethode. Met een optimale combinatie van licht en RB werd 3-log groeiremming bereikt. Er werd geconcludeerd dat RB-aPDT mogelijk medicijnresistente C. albicans zou kunnen remmen.
Introduction
C. albicans koloniseert in de gastro-intestinale en urogenitale tractus van gezonde personen en kan worden gedetecteerd als normale microbiota in ongeveer 50 procent van de individuen1. Als er een onbalans wordt gecreëerd tussen de gastheer en de ziekteverwekker, is C. albicans in staat om binnen te dringen en ziekte te veroorzaken. De infectie kan variëren van lokale slijmvliesinfecties tot meervoudig orgaanfalen2. In een multicenter surveillancestudie in de VS is ongeveer de helft van de isolaten van patiënten met invasieve candidiasis tussen 2009 en 2017 C. albicans3. Candidemie kan worden geassocieerd met hoge morbiditeitscijfers, mortaliteit, langdurig ziekenhuisverblijf4. Amerikaanse Centers of Disease Control and Prevention meldden dat ongeveer 7% van alle geteste Candida-bloedmonsters resistent zijn tegen het antischimmelmiddel fluconazol5. De opkomst van medicijnresistente Candida-soorten verhoogt de bezorgdheid om een alternatieve of adjuvante therapie voor antimycotische middelen te ontwikkelen.
Antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) omvat het activeren van een specifieke fotosensitizer (PS) met licht op de piekabsorptiegolflengte van de PS6. Na excitatie brengt de aangeslagen PS zijn energie of elektronen over naar de nabijgelegen zuurstofmoleculen en keert terug naar de grondtoestand. Tijdens dit proces worden reactieve zuurstofsoorten en singletzuurstof gevormd en veroorzaken celschade. aPDT is op grote schaal gebruikt om micro-organismen te doden sinds de jaren 19907. Een van de voordelen van aPDT is dat meerdere organellen in een cel beschadigd raken door singlet zuurstof en/of reactieve zuurstofsoorten (ROS) tijdens bestraling; resistentie tegen aPDT is dus tot op de dag van vandaag niet gevonden. Bovendien meldde een recente studie dat de bacteriën die overleefden na aPDT gevoeliger werden voor antibiotica8.
De lichtbronnen die in aPDT worden gebruikt, zijn lasers, metalen halogeenlampen met filters, nabij-infrarood licht en light-emitting diode (LED)9,10,11,12. De laser levert een hoog lichtvermogen, meestal groter dan 0,5 W/cm2, dat de levering van een hoge lichtdosis in een zeer korte tijd mogelijk maakt. Het is veel gebruikt in gevallen waar een langere behandelingstijd onhandig is, zoals aPDT voor orale infecties. Het nadeel van een laser is dat de spotgrootte van verlichting klein is, variërend van een paar honderd micrometer tot 10 mm met een diffuser. Bovendien is laserapparatuur duur en heeft het specifieke training nodig om te kunnen werken. Aan de andere kant is het bestralingsgebied van een metalen halogeenlamp met filters relatief groter13. De lamp is echter te fors en te duur. LED-lichtbronnen zijn mainstream geworden van aPDT op dermatologisch gebied omdat het klein en goedkoper is. Het bestralingsgebied kan relatief groot zijn met een array-opstelling van de LED-lamp. Het hele gezicht kan tegelijkertijd worden verlicht9. Niettemin zijn de meeste, zo niet alle, LED-lichtbronnen die tegenwoordig beschikbaar zijn, ontworpen voor klinisch gebruik. Het is misschien niet geschikt voor experimenten in een laboratorium omdat het ruimte in beslag neemt en duur is. We hebben een goedkope LED-array ontwikkeld die erg klein is en uit een LED-strip kan worden gesneden en gemonteerd. De LED’s kunnen in verschillende opstellingen worden gemonteerd voor verschillende experimentele ontwerpen. Verschillende omstandigheden van aPDT kunnen in één experiment worden voltooid in een 96-well plaat of zelfs een 384-well plaat.
Rose bengal (RB) is een gekleurde kleurstof die veel wordt gebruikt om de visualisatie van hoornvliesschade in menselijke ogen te verbeteren14. RB-gemedieerde aPDT heeft dodelijke effecten aangetoond op Staphylococcus aureus, Escherichia coli en C. albicans met ongeveer vergelijkbare efficiëntie als die van Toluidine blue O15. Deze studie toont een methode om het effect van RB-aPDT op multiresistente C. albicans te valideren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bemoedigende resultaten van klinische toepassingen van RB-PDT voor schimmelkeratitis zijn onlangs gemeld19. De absorptiepiek van RB ligt bij 450-650 nm. Het is essentieel om de fluence rate van de lichtbron te bepalen voor een succesvolle aPDT. Een hoge fluence (meestal >100 J/cm2) is vereist om kankercellen te behandelen, terwijl een lagere fluence naar verwachting geïnfecteerde laesies zal behandelen6. Een hoge fluence betekent een lange blootstellingstijd die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk heeft financiering ontvangen van het Center of Applied Nanomedicine, National Cheng Kung University van het Featured Areas Research Center Program in het kader van het Higher Education Sprout Project door het ministerie van Onderwijs (MOE) en het ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan [MOST 109-2327-B-006-005] aan TW Wong. J.H. Hung erkent financiering van het National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11006018], en [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].
Materials
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | disperses heat from the LED array |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
- Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).
- Pappas, P. G., et al. Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).
- Ricotta, E. E., et al. Invasive candidiasis species distribution and trends, United States, 2009-2017. Journal of Infectious Diseases. 223 (7), 1295-1302 (2021).
- Koehler, P., et al. Morbidity and mortality of candidaemia in Europe: an epidemiologic meta-analysis. Clinical Microbiology and Infection. 25 (10), 1200-1212 (2019).
- Toda, M., et al. Population-based active surveillance for culture-confirmed candidemia – four sites, United States, 2012-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 68 (8), 1-15 (2019).
- Lee, C. N., Hsu, R., Chen, H., Wong, T. W. Daylight photodynamic therapy: an update. Molecules. 25 (21), 5195 (2020).
- Wainwright, M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 42 (1), 13-28 (1998).
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance. Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411 (2019).
- Kim, M. M., Darafsheh, A. Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).
- Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. Photodynamic therapy for Bowen’s disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit. Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).
- Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
- Stasko, N., et al. Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue. Scientific Reports. 11 (1), 20595 (2021).
- Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).
- Feenstra, R. P., Tseng, S. C. Comparison of fluorescein and rose bengal staining. Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).
- Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).
- Shahid, H., et al. Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities. Frontiers in Microbiology. 12, 766440 (2021).
- Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).
- Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition. Frontiers in Immunology. 8, 629 (2017).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
- Martinez, J. D., et al. Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study. Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).
