Cocultivo de organoides epiteliales del intestino delgado murino con células linfoides innatas

La comunicación entre el epitelio intestinal y el sistema inmunitario residente en el intestino es fundamental para el mantenimiento de la homeostasis intestinal¹. Las interrupciones de estas interacciones se asocian con enfermedades locales y sistémicas, incluida la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y los cánceres gastrointestinales². Un ejemplo notable de un regulador crítico de la homeostasis descrito más recientemente proviene del estudio de las células linfoides innatas (ILC), que han surgido como actores clave en el panorama inmunológico intestinal³. Las ILC son un grupo de células inmunes innatas heterogéneas que regulan la homeostasis intestinal y orquestan la inflamación en gran medida a través de la señalización mediada por citoquinas⁴.

Las ILC murinas se dividen ampliamente en subtipos basados en los perfiles de expresión de factores de transcripción, receptores y citoquinas⁵. Las ILC de tipo 1, que incluyen células asesinas naturales (NK) citotóxicas y ILC tipo 1 similares a las auxiliares (ILC1), se definen por la expresión del factor de transcripción (eomesodermina) Eomes y la proteína T-box expresadas en células T (T-bet)⁶, respectivamente, y secretan citoquinas asociadas con la inmunidad T helper tipo 1 (T_H1): interferón-γ (IFNγ) y factor de necrosis tumoral (TNF), en respuesta a la interleucina (IL)-12, IL-15 e IL-18⁷. Durante la homeostasis, los ILC1 residentes en el tejido secretan factor de crecimiento transformador β (TGF-β) para impulsar la proliferación epitelial y la remodelación de la matriz⁸. Las ILC tipo 2 (ILC2) responden principalmente a la infección por helmintos a través de la secreción de citoquinas asociadas al T ayudante tipo 2 (T_H2): IL-4, IL-5 e IL-13, y se caracterizan por la expresión del receptor huérfano relacionado con el ácido retinoico (ROR) α (ROR-α)⁹ y la proteína de unión a GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . En ratones, las ILC2 “inflamatorias” intestinales se caracterizan además por la expresión del receptor similar a la lectina de células asesinas (miembro G de la subfamilia G 1, KLRG)¹³ donde responden a il-25 derivada de células epiteliales del mechón^14,15. Finalmente, las ILC tipo 3, que incluyen células inductoras de tejido linfoide y ILC tipo 3 similares a ayudantes (ILC3), dependen del factor de transcripción ROR-γt¹⁶ y se agrupan en grupos que secretan factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF), IL-17 o IL-22 en respuesta a las señales locales de IL-1β e IL-23¹⁷. Las células inductoras de tejido linfoide se agrupan en los parches de Peyer y son cruciales para el desarrollo de estos órganos linfoides secundarios durante el desarrollo¹⁸, mientras que las ILC3 son el subtipo de ILC más abundante en la lámina propia del intestino delgado murino adulto. Uno de los primeros sistemas de cocultivo de organoides intestinales murinos con ILC3 se aprovechó para separar el impacto de la citoquina IL-22 en el transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT-3) mediado por la repetición rica en leucina que contiene el receptor acoplado a proteína G 5 (Lgr5) ⁺ proliferación de células madre intestinales¹⁹, un poderoso ejemplo de una interacción regenerativa ILC-epitelial. Las ILC exhiben impronta-heterogeneidad entre órganos^20,21 y exhiben plasticidad entre subconjuntos en respuesta a citoquinas polarizantes²². Lo que impulsa estas huellas específicas de los tejidos y las diferencias de plasticidad, y qué papel desempeñan en enfermedades crónicas como la EII²³, siguen siendo temas emocionantes que podrían abordarse utilizando cocultivos organoides.

Los organoides intestinales han surgido como un modelo exitoso y fiable para estudiar el epitelio intestinal^24,25. Estos se generan mediante el cultivo de células madre epiteliales intestinales Lgr5 ⁺, o criptas aisladas completas, que incluyen células de Paneth como una fuente endógena de Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Estas estructuras 3D se mantienen en hidrogeles sintéticos²⁶ o en biomateriales que imitan la lámina basal propia, por ejemplo, la matriz extracelular basal de reticulación térmica (TBEM), y se complementan con factores de crecimiento que imitan el nicho circundante, especialmente el factor de crecimiento epitelial (EGF), el inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP) Noggin, y un ligando Lgr5 y un agonista Wnt R-Spondin1²⁷ . Bajo estas condiciones, los organoides mantienen la polaridad epitelial apico-basal y recapitulan la estructura cripta-vellosidad del epitelio intestinal con criptas de células madre en ciernes que se diferencian terminalmente en células absorbentes y secretoras en el centro del organoide, que luego se desprenden en el pseudoplume interno por anoikis²⁸. Aunque los organoides intestinales por sí solos han sido enormemente ventajosos como modelos reduccionistas del desarrollo epitelial y la dinámica en aislamiento^29,30, tienen un tremendo potencial futuro para comprender cómo estos comportamientos son regulados, influenciados o incluso interrumpidos por el compartimiento inmune.

En el siguiente protocolo se describe un método de cocultivo entre organoides del intestino delgado murino y lámina propia derivada de ILC1s, que se utilizó recientemente para identificar cómo esta población disminuye inesperadamente las firmas intestinales de inflamación y en su lugar contribuye a aumentar la proliferación epitelial a través de TGF-β en este sistema⁸.