ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट चूहों का उपयोग करते हुए, विस्तृत प्रोटोकॉल जीवित जानवरों में बरकरार कटिस्नायुशूल तंत्रिका के मोटर और संवेदी अक्षतंतु के भीतर सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया के विवो एक्सोनल परिवहन में आकलन करने के लिए वर्णित हैं।
एक्सोनल परिवहन विभिन्न ऑर्गेनेल और कार्गो की द्विदिश तस्करी को सक्षम करके न्यूरोनल होमियोस्टेसिस को बनाए रखता है। अक्षीय परिवहन में व्यवधान व्यक्तिगत न्यूरॉन्स और उनके नेटवर्क के लिए विनाशकारी परिणाम हैं, और न्यूरोलॉजिकल विकारों की अधिकता में योगदान करते हैं। चूंकि इनमें से कई स्थितियों में सेल स्वायत्त और गैर-स्वायत्त तंत्र दोनों शामिल हैं, और अक्सर न्यूरोनल उपप्रकारों में पैथोलॉजी का एक स्पेक्ट्रम प्रदर्शित करते हैं, न्यूरोनल सबसेट को सटीक रूप से पहचानने और विश्लेषण करने के तरीके अनिवार्य हैं।
यह पेपर संवेदनाहारी चूहों के कटिस्नायुशूल तंत्रिकाओं में सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया के विवो एक्सोनल परिवहन में आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का विवरण देता है। चरणबद्ध निर्देश प्रदान किए जाते हैं 1) विवो में संवेदी न्यूरॉन्स से मोटर को अलग करें , सीटू में, और पूर्व विवो चूहों का उपयोग करके जो चुनिंदा कोलीनर्जिक मोटर न्यूरॉन्स के भीतर फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं; और 2) सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया के विवो एक्सोनल परिवहन में अलग-अलग या समवर्ती मूल्यांकन करें। ये पूरक इंट्रावाइटल दृष्टिकोण स्वास्थ्य और बीमारी में अक्षीय परिवहन की मात्रात्मक निगरानी के लिए अलग-अलग परिधीय तंत्रिका अक्षतंतु में विभिन्न कार्गो की एक साथ इमेजिंग की सुविधा प्रदान करते हैं।
परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएनएस) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को अपने डिस्टल लक्ष्यों से जोड़ता है, जिससे अपवाही संकेतों के रिले को संवेदी प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए मोटर नियंत्रण और अभिवाही संकेतों को लागू करने की अनुमति मिलती है। माउस आनुवंशिकी में प्रगति की भीड़ का उपयोग करते हुए, वैज्ञानिकों ने पीएनएस 1,2,3 को पीड़ित करने वाली कई बीमारियों / सिंड्रोमकी जांच करने के लिए विभिन्न माउस मॉडल विकसित किए हैं। चूंकि अधिकांश न्यूरोडीजेनेरेटिव विकृतियां सेल स्वायत्त और गैर-स्वायत्त योगदान 4,5 के साथ बहुआयामी हैं, इसलिए अनटैंगलिंग सेल-/ न्यूरॉन-विशिष्ट विकृतियां रोग तंत्र में महत्वपूर्ण, उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती हैं।
यह अंत करने के लिए, जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी) -ट्रांसजेनिक चूहों6 के विकास ने न्यूरॉन्स के लक्षित सबसेट में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की चयनात्मक अंतर्जात अभिव्यक्ति को सक्षम किया है। उदाहरण के लिए, बीएसी-ट्रांसजेनिक चूहे उपलब्ध हैं, जो कोलीनर्जिक7 या ग्लाइसिनर्जिक न्यूरॉन्स8 में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) या परवलबुमिन-पॉजिटिव न्यूरॉन्स9 में एक संस्करण लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (टीडीटोमैटो) व्यक्त करते हैं। वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की चयनात्मक न्यूरोनल अभिव्यक्ति क्रे-लॉक्सपी प्रौद्योगिकी10 के माध्यम से प्राप्त की जा सकती है। उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स के सबसेट में क्रे-रिकंबिनेज को व्यक्त करने वाले माउस उपभेदों (जैसे, कोलीन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ (सीएचएटी) -क्रे) को चूहों के साथ नस्ल किया जा सकता है जो एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, टीडीटोमैटो या जीएफपी) को एक संवैधानिक स्थान (जैसे,जीटी ( आरओएसए) 26 सोर) से व्यक्त करते हैं। दरअसल, क्रे-लॉक्सपी पुनर्संयोजन का उपयोग करके, ट्रांसजेनिक चूहों को उत्पन्न किया गया है जो अवरोही कॉर्टिकोस्पाइनल ट्रैक्ट12 के अक्षतंतु में पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करते हैं।
कैस 9 जीन संपादन में हालिया प्रगति, जैसे ऑरेंज, नैनोस्केल रिज़ॉल्यूशन13 पर प्राप्त अभिव्यक्ति के साथ कई अंतर्जात न्यूरोनल प्रोटीन के फ्लोरोसेंट टैगिंग को सक्षम करती है। इसके अलावा, क्रे-एक्सप्रेसिंग माउस उपभेदों के साथ संयोजन में, ऑरेंज-केक का उपयोग व्यक्तिगत न्यूरॉन्स13 में कई अंतर्जात प्रोटीन को टैग करने के लिए किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, वायरल-मध्यस्थता न्यूरोनल ट्रेसिंग भी न्यूरोनल सबसेट के लेबलिंग की अनुमति देती है और वायरल सीरोटाइप और / या सेल-विशिष्ट प्रमोटरों 14,15,16,17 के लक्षित संयोजनों के साथ प्राप्त की जा सकती है।
न्यूरोनल लेबलिंग विधियों के अलावा, माउस लाइनों को विशिष्ट ऑर्गेनेल को लक्षित करने वाले रिपोर्टर प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए भी इंजीनियर किया गया है, जैसे कि माइटोकॉन्ड्रिया सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (माइटो.सीएफपी) 18 या जीएफपी (एलसी 3.जीएफपी) 19 व्यक्त करने वाले ऑटोफैगोसोम। इसके अलावा, माउस लाइनों को विशेष रूप से न्यूरॉन्स (जैसे, थाइ1.जीसीएएमपी) 20,21 में कैल्शियम गतिशीलता का आकलन करने के लिए इंजीनियर किया गया है। कुल मिलाकर, ऐसे मॉडलों की उन्नति के साथ, उपन्यास प्रयोगात्मक अनुप्रयोग वैज्ञानिकों को सीएनएस और पीएनएस के बारे में अधिक सटीक जैविक और रोग संबंधी प्रश्न पूछने में सक्षम बनाते हैं।
परिधीय मोटर नसों की मुख्य भूमिका आंदोलन को प्राप्त करने के लिए कंकाल की मांसपेशियों में विद्युत संकेतों को संचारित करना है। इसके अलावा, और लंबे समय तक होने वाले पैमानों पर होने वाले, विभिन्न ऑर्गेनेल (जैसे, माइटोकॉन्ड्रिया, एंडोलिसोसोम, सिग्नलिंग एंडोसोम) के रूप में न्यूरोकेमिकल और शारीरिक संदेश न्यूरोनल होमियोस्टेसिस22,23,24 को बनाए रखने में मदद करने के लिए एक यूनी- या द्वि-दिशात्मक तरीके से साइटोस्केलेटल नेटवर्क को पार करते हैं। एक्सोनल परिवहन में हानि के न्यूरोनल स्वास्थ्य के लिए विनाशकारी परिणाम हैं और कई न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों से जुड़ेहैं 25. आणविक स्तर पर, अक्षीय परिवहन में हानि सिनैप्टिक सिग्नलिंग और प्लास्टिसिटी, जीन प्रतिलेखन और अक्षतंतु26,27 में स्थानीय अनुवाद को विनियमित करने वाली शारीरिक घटनाओं को बाधित कर सकती है। न्यूरॉन्स28,29 में इन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए उपकरणों की एक भीड़ है, विवो में अक्षतंतु परिवहन गतिशीलता और अक्षीय-लिंक्ड जैविक घटनाओं का आकलन शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है30.
इन वर्षों में, शियावो प्रयोगशाला ने एक्सोनल परिवहन 31,32,33,34,35,36 के बारे में विविध प्रश्न पूछने के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन किया है। इन प्रयोगों ने इस खोज से विस्तार किया है कि टेटनस न्यूरोटॉक्सिन (एचसीटी) के एक फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एटॉक्सिक टुकड़े को कंकाल की मांसपेशियों में अक्षतंतु टर्मिनलों में निडोजेन और पॉलीसियालोगैंगलियोसाइड्स37 के साथ बातचीत के माध्यम से आंतरिक किया जाता है। एक बार आंतरिक होने के बाद,एचसीटीको प्रतिगामी रूप से रब 7-पॉजिटिव, न्यूरोट्रॉफिन युक्त सिग्नलिंग एंडोसोम में ले जाया जाता है जो मोटर और संवेदी न्यूरॉन्स 38,39,40,41 के सेल निकायों के लिए नियत होते हैं। समानांतर में, इमेजिंग प्रौद्योगिकी में प्रगति ने परिधीय तंत्रिका बंडलों और जीवित, संवेदनाहारी चूहों30 में व्यक्तिगत अक्षतंतु के वास्तविक समय विश्लेषण को सक्षम किया है। पैथोलॉजी में विवो एक्सोनल ट्रांसपोर्ट डायनेमिक्स में आकलन करने में पहले प्रयास से एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) 35 के एसओडी 1जी 9 3 ए माउस मॉडल में सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया के परिवहन में प्रीसिम्प्टोमैटिक हानि का पता चला। महत्वपूर्ण रूप से, इन दोषों को न्यूरोडीजेनेरेशन के माध्यमिक परिणामों का प्रतिनिधित्व करने की संभावना नहीं है, यह देखते हुए कि मोटर न्यूरॉन हानि कैनेडी की बीमारी42 के माउस मॉडल में अक्षीय परिवहन गड़बड़ी की अनुपस्थिति में हो सकती है और एएलएस43 का एक विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती एफयूएस मॉडल। इस तरह के अक्षीय परिवहन घाटे को विशिष्ट किनेसेस33 या विकास कारक रिसेप्टर्स34 के अवरोधकों का उपयोग करके एएलएस चूहों में ठीक किया जा सकता है। इसके अलावा, एक विशिष्ट हिस्टोन डेसिटाइलेज अवरोधक के साथ न्यूरॉन्स का इलाज विवो36 में माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन को बदल देता है। हाल ही में, हम रिपोर्ट करते हैं कि अक्षतंतु परिवहन के बीडीएनएफ-निर्भर मॉडुलन को एएलएस चूहों44 में अलग-अलग मोटर न्यूरॉन उपप्रकारों में विनियमित किया जाता है।
एक्सोनल ट्रांसपोर्टडायनेमिक्स 28,29 का आकलन करने के लिए एक कभी-विस्तारित टूलकिट का उपयोग करके, यह वीडियो प्रोटोकॉल कई अनुप्रयोगों को रेखांकित करता है जो विभिन्न जैविक और रोग परिदृश्यों में आगे की अंतर्दृष्टि की अनुमति देंगे। सबसे पहले, ट्रांसजेनिक चूहों जो चुनिंदा रूप से कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स (यानी, मोटर न्यूरॉन्स) में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं, का उपयोग विवो और पूर्व विवो दोनों में मोटर और संवेदी अक्षतंतु के बीच भेदभाव करने के लिए किया जाता है। फ्लोरोसेंटली लेबलएचसीटीको तब अलग-अलग परिधीय न्यूरॉन्स में अक्षीय परिवहन गतिशीलता को अलग करने के लिए तीन ट्रांसजेनिक लाइनों में सिग्नलिंग एंडोसोम में लोड किया जाता है। अगले प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल मितो-सीएफपी चूहों के साथ ChAT.tdTomato चूहों प्रजनन द्वारा विशेष रूप से मोटर न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन का आकलन करने के लिए एक मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति दृष्टिकोण का विवरण देता है। अंत में, विवो में एक ही अक्षतंतु के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया और सिग्नलिंग एंडोसोम को समवर्ती रूप से छवि देने के निर्देश दिए जाते हैं।
यह प्रोटोकॉल माउस कटिस्नायुशूल तंत्रिका के बरकरार अक्षतंतु में सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया के विवो एक्सोनल परिवहन में आकलन करने के लिए चरणों का विवरण देता है। दरअसल, एक प्रयोगात्मक सेटअप प्रदान किया जाता है जो उपयोगकर्ताओं को सक्षम बनाता है 1) मोटर न्यूरॉन्स में संवेदी न्यूरॉन्स से मोटर को अलग करता है विवो में, सीटू में, और पूर्व विवो में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन को व्यक्त करने वाले चूहों का उपयोग करके चुनिंदा मोटर न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है; 2) विशेष रूप से तीन अलग-अलग ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन अक्षतंतु में सिग्नलिंग एंडोसोम के विवो एक्सोनल परिवहन में आकलन करें; 3) विशेष रूप से मोटर न्यूरॉन अक्षतंतु में माइटोकॉन्ड्रिया के विवो एक्सोनल परिवहन में जांच करें; और 4) एक ही अक्षतंतु के भीतर सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया की विवो परिवहन गतिशीलता में समवर्ती मूल्यांकन करें। इस दृष्टिकोण में बेसल स्थितियों में अक्षीय परिवहन की जांच करने की विशाल क्षमता है और इसका उपयोग परिधीय मोटर और संवेदी तंत्रिकाओं को प्रभावित करने वाले विभिन्न रोगों में रोग संबंधी गड़बड़ी का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
नींव31,32 के रूप में पिछले प्रयोगात्मक प्रतिमानों का उपयोग करते हुए, यहां हमारे पास ट्रांसजेनिक रिपोर्टर चूहों का उपयोग करके मोटर बनाम संवेदी न्यूरॉन्स में होने वाले अक्षीय परिवहन को अलग करने के विस्तृत उपन्यास, मजबूत तरीके हैं। सीएफपी माउस का उपयोग करते हुए, इस दृष्टिकोण को टीएमआरई36 के इंट्रासाइटिक तंत्रिका इंजेक्शन से परहेज करके विवो माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन में आकलन करने के लिए विकसित किया गया है। यह जांच के इंट्रानेर्व इंजेक्शन के कारण एक्सोनल परिवहन में संभावित तंत्रिका क्षति और गड़बड़ी को दरकिनार करता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल मोटर अक्षतंतु में कई ऑर्गेनेल के अक्षीय परिवहन के दृश्य की अनुमति देता है जो अलग-अलग शारीरिक गुणों (जैसे, फास्ट-ट्विच फैटिगेबल मांसपेशियों बनाम धीमी-चिकोटी थकान प्रतिरोधी मांसपेशियों) के साथ मांसपेशियों को आंतरिक बनाता है। जैसे, सिग्नलिंग एंडोसोम और / या माइटोकॉन्ड्रियल एक्सोनल ट्रांसपोर्ट डायनेमिक्स का मूल्यांकन α-मोटर न्यूरॉन्स44 के विभिन्न सबसेट में किया जा सकता है। इसके अलावा, पैथोलॉजिकल सेटिंग्स में उन ऑर्गेनेल के अक्षीय परिवहन का मूल्यांकन विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों 1,2,3 के माउस मॉडल के साथ क्रॉसब्रीडिंग के माध्यम से भी किया जा सकता है।
एक्सोनल ट्रांसपोर्ट टूलकिट लगातार28,29 का विस्तार कर रहा है, और पूर्व विवो प्रोटोकॉल सुसंस्कृत माउस वेंट्रल हॉर्न एक्सप्लांट्स49 या एक्साइज्ड माउस तंत्रिका-मांसपेशियों की तैयारी50 का उपयोग करके परिवहन गतिशीलता का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है। इसके अलावा, प्रेरित मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) -व्युत्पन्न कॉर्टिकल51 न्यूरॉन्स या एचआईपीएससी-व्युत्पन्न रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स52 में अक्षीय परिवहन का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल के विकास ने रोग पैदा करने वाले उत्परिवर्तन के साथ मानव न्यूरॉन्स की जांच को सक्षम किया है। माउस ऊतक और मानव कोशिकाओं में इस तरह के अत्याधुनिक प्रोटोकॉल न्यूरोनल फ़ंक्शन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग मॉडल में उपन्यास रोग तंत्र की खोज की सुविधा प्रदान कर सकते हैं, और चिकित्सीय अणुओं और रणनीतियों का परीक्षण करने के लिए उपयोग किए जा सकते हैं।
इन तकनीकों के सफल कार्यान्वयन के लिए कई महत्वपूर्ण चरणों का पालन करने की आवश्यकता है, और प्रोटोकॉल अनुभाग में कुछ महत्वपूर्ण नोट्स प्रदान किए गए हैं। इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए प्रमुख आवश्यकताएं अनुकूलित चरण डालने के साथ उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और संज्ञाहरण और इष्टतम तापमान बनाए रखने के लिए उपकरण हैं। दरअसल, 1) संज्ञाहरण के प्रेरण के लिए एक विशेष मोबाइल संवेदनाहारी प्रणाली की आवश्यकता होती है, 2) विच्छेदन / ऊतक प्रसंस्करण (यानी, कटिस्नायुशूल तंत्रिका को उजागर करना), और 3) इंट्रावाइटल इमेजिंग के दौरान संज्ञाहरण बनाए रखना (जैसा कि पहले 31,32 में विस्तृत है)। विशेष रूप से उच्च आवर्धन उद्देश्यों (जैसे, 40x या 63x) का उपयोग करते समय, संज्ञाहरण की गहराई छवि की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकती है, क्योंकि गहरी संज्ञाहरण बड़ी ‘गैसी’ सांसों को प्रेरित करती है जिसके परिणामस्वरूप फोकस में लगातार बदलाव होता है। इस तरह के बड़े आंदोलननिश्चित रूप से पोस्ट इमेजिंग परिवहन विश्लेषण (जैसे, फिजी प्लगइन्स ट्रैकमेट53 या किमोएनालाइज़र54 का उपयोग करके कार्गो को ट्रैक करना) को प्रभावित करेंगे क्योंकि श्वास आंदोलन समय-चूक वीडियो में कलाकृतियों का उत्पादन करते हैं जो उन्हें स्वचालित ट्रैकिंग के लिए अनुपयुक्त प्रदान कर सकते हैं या अधिक समय लेने वाले मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, हमने कटिस्नायुशूल तंत्रिका के भीतर स्पंदित धमनियों के कारण इमेजिंग कलाकृतियों को भी देखा है, जिसे केवल एक अलग इमेजिंग क्षेत्र चुनकर हल किया जा सकता है। माइक्रोस्कोप को निरंतर शरीर के तापमान को बनाए रखने में सक्षम एक पर्यावरणीय कक्ष से सुसज्जित किया जाना चाहिए, क्योंकि तापमान और पीएच प्रभाव अक्षीय परिवहन55। इसके अलावा, सर्जरी के बाद एनाल्जेसिक के आवेदन से बचा जाना चाहिए, क्योंकि वे परिवहन गतिशीलता56 को बदल सकते हैं। यदि प्रयोगात्मक डिजाइन अनुदैर्ध्य है और बार-बार इमेजिंग (जैसे, 57) की आवश्यकता होती है, तो विच्छेदन प्रोटोकॉल को न्यूनतम इनवेसिव होने के लिए उचित रूप से समायोजित करने की आवश्यकता होती है और अतिरिक्त नैतिक /
कुछ प्रायोगिक विचारों को ध्यान में रखने की आवश्यकता है। सबसे पहले, यहां विस्तृत अधिकांश प्रोटोकॉल में ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग शामिल है जो माइटोकॉन्ड्रिया या मोटर न्यूरॉन अक्षतंतु में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन रखते हैं। इन माउस लाइनों में से प्रत्येक को हेमी-/ विषमयुग्मजी के रूप में नस्ल और चित्रित किया जाना चाहिए। अपवाद, हालांकि, चैट.क्रे और रोसा 26.टीडीटोमैटो माउस लाइनें हैं जिन्हें अलग से होमोजाइगोट्स के रूप में बनाए रखा जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप हेमिजाइगोट संतानों ने क्रे-लॉक्सपी पुनर्संयोजन के बाद कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स में टीडीटोमैटो अभिव्यक्ति को सक्षम किया है। विषमयुग्मजी चूहों (जैसे, चैट.ईजीएफपी) के साथ क्रॉस-ब्रीडिंग ट्रांसजेनिक हेमी-/ विषमयुग्मजी चूहों (जैसे, माइटो.सीएफपी), किसी को प्रजनन रणनीति पर सावधानीपूर्वक विचार करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि डबल-उत्परिवर्ती संतान की वांछित संख्या प्राप्त करना समय लेने वाला हो सकता है। इसके अलावा, अतिरिक्त ट्रांसजेनिक उपभेदों (जैसे, माइटो.सीएफपी) के साथ चैट.क्रे और रोजा 26.टीडीटोमैटो चूहों (यानी, सीएचएटी.टीडीटोमैटो) की एफ 1 पीढ़ी का प्रजनन करते समय, किसी को वांछित ट्रिपल ट्रांसजीन ले जाने वाले कम चूहों की उम्मीद करनी चाहिए। इसके अलावा, किसी को पास के तरंग दैर्ध्य गुणों के साथ दो-रिपोर्टर चूहों को प्रजनन करते समय संभावित फ्लोरोफोर ओवरलैप पर भी विचार करना चाहिए (उदाहरण के लिए, मितो-सीएफपी-उत्तेजना: 435 एनएम, उत्सर्जन: 485 एनएम, चैट.ईजीएफपी-उत्तेजना के साथ नस्ल: 488 एनएम, उत्सर्जन: 510 एनएम), हालांकि वर्णक्रमीय अनमिक्सिंग58 के साथ इस समस्या को दूर करना संभव हो सकता है।
इस तकनीक की कुछ सीमाएं हैं जिन पर विचार किया जाना चाहिए। इस काम और हमारे पिछले प्रोटोकॉल31,32 में, हमने दिखाया है कि विवो में अलग-अलग ऑर्गेनेल को लेबल और ट्रैक करने के लिए कई आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड मार्करों और विभिन्न धुंधला तरीकों का उपयोग कैसे किया जा सकता है। हालांकि, सभी जांच इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त नहीं हैं। हमने हैजा विष बीटा सबयूनिट (सीटीबी) -488 (इमेजिंग से पहले 0.5-1.5 μg / μL ~ 4 घंटे) के टीए या सोलस मांसपेशियों में इंजेक्शन का आकलन किया, एक जांच नियमित रूप से विवो प्रतिगामी अनुरेखक प्रयोगों59,60 में मोटर न्यूरॉन सेल निकायों को लेबल करने के लिए उपयोग की जाती है। हालांकि, जब अकेले इंजेक्शन दिया जाता है याएचसीटी -555 के साथ सह-इंजेक्शन दिया जाता है, तो सफल प्रतिगामी मोटर न्यूरॉन ट्रेसिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले सांद्रता के समान सांद्रता का उपयोग करने के बावजूद सीटीबी -488 लेबलिंग खराब थी। इस प्रकार, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि, सीटीबी न्यूरोनल संस्कृतियों61 में सिग्नलिंग एंडोसोम के इन विट्रो मार्कर में एक उत्कृष्ट होने के बावजूद,एचसीटीकटिस्नायुशूल तंत्रिका अक्षतंतु में विवो में सिग्नलिंग एंडोसोम की पहचान करने के लिए स्वर्ण-मानक जांच बनी हुई है।
विभिन्न मार्गों का उपयोग करते हुए, हमने लाइसोसोम को लेबलिंग के लिए नियमित रूप से उपयोग की जाने वाली जांच का भी परीक्षण किया, जैसे कि लाइसोट्रैकर ग्रीन डीएनडी -26, और सक्रिय लाइसोसोमल हाइड्रोलेज़ के मार्कर, जैसे कैथेप्सिन डी62 के लिए बीओडीआईपीवाई-एफएल-पेप्स्टेटिन ए और कैथेप्सिन बी के लिए मैजिक रेड, लेकिन कोई सफलता नहीं मिली। हमने इमेजिंग से पहले टीए ~ 4 घंटे में 2.5 μg) के इंट्रामस्क्युलर डिलीवरी की कोशिश की, साथ ही इमेजिंग से पहले लाइसोट्रैकर (10 μM), BODIPY-FL-पेप्स्टेटिन ए (10 μM) या मैजिक रेड (1/10) 30-60 मिनट के इंट्रास्कुलेटिक तंत्रिका इंजेक्शन। तंत्रिका को उजागर करने वाली इन जांचों के बावजूद, हम स्पष्ट रूप से लेबल वाले ऑर्गेनेल खोजने में असमर्थ थे। जांच अक्षतंतु के आसपास जमा हुई, संभवतः श्वान कोशिकाओं द्वारा बनाए रखा जा रहा है। इसलिए, लाइसोसोम की असफल लेबलिंग न्यूरॉन्स में जांच वितरण की कमी के कारण हो सकती है, हालांकि अधिक उपयुक्त सांद्रता के अस्तित्व से इनकार नहीं किया जा सकता है। यह देखते हुए कि टीएमआरई लेबलिंग समान परिस्थितियों (यानी, इंट्रासियटिक तंत्रिका इंजेक्शन) के तहत काम करती है, लेबलिंग तीव्रता डाई-निर्भर हो सकती है और प्रत्येक मार्कर के लिए स्वतंत्र रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए। हालांकि, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि इन जांचों के साथ विवो में लाइसोसोम को लक्षित करना ऊपर बताई गई सांद्रता पर संभव नहीं है।
संज्ञाहरण के तरीके अलग-अलग शारीरिक रीडआउट को बदल सकते हैं (उदाहरण के लिए, कोक्लीआ फ़ंक्शन63 और कॉर्टिकल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी64); हालाँकि, क्या कटिस्नायुशूल तंत्रिका में विवो एक्सोनल परिवहन में संज्ञाहरण प्रभाव वर्तमान में अज्ञात है। आइसोफ्लूरेन-प्रेरित संज्ञाहरण के तहत कम न्यूरोमस्कुलर गतिविधि को देखते हुए, यह संभव है कि परिवहन कैनेटीक्स जागृत अवस्था की तुलना में भिन्न हो। हालांकि, एकमात्र इन विवो अध्ययन जिसने सीधे इसकी जांच की है, से पता चला है कि थैलेमोकोर्टिकल अनुमानों में घने कोर पुटिकाओं का परिवहन संवेदनाहारी और जागृत चूहों65 के बीच भिन्न नहीं होता है। इसके अलावा, क्योंकि जंगली प्रकार और रोग मॉडल चूहों के बीच परिवहन में अंतर संज्ञाहरण35,43 के तहत पता लगाने योग्य हैं, यह स्पष्ट है कि आइसोफ्लूरेन एक्सपोजर एंडोसोम या माइटोकॉन्ड्रियल तस्करी के संकेत में गड़बड़ी की पहचान को नहीं रोकता है।
इस प्रोटोकॉल में अन्य संभावित अनुप्रयोग हैं, जिन्हें नीचे वर्णित किया गया है। न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग माउस मॉडल 1,2,3 के साथ इस प्रोटोकॉल (जैसे, माइटो.सीएफपी, सीएचएटी.ईजीएफपी) में उल्लिखित ट्रांसजेनिक चूहों का प्रजनन न्यूरॉन उपप्रकार- और / इसके अलावा, हाल ही में विकसित माउस क्रे लाइनें66 अलग-अलग संवेदी अक्षतंतु आबादी में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के दृश्य की भी अनुमति देगी। उदाहरण के लिए, रोसा 26.टीडीटोमैटो चूहों को न्यूरोपेप्टाइड वाई रिसेप्टर -2-एक्सप्रेसिंग (एनपीवाई 2 आर) के साथ पार किया जा सकता है। माइलिनेटेड ए-फाइबर नोसिसेप्टर्स67 में टीडीटोमैटो प्रतिदीप्ति को सक्षम करने के लिए क्रे माउस। इसके अलावा, अस्थायी नियंत्रण भी उत्प्रेरणीय क्रे सिस्टम (जैसे, टैमोक्सीफेन)68 का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। एक अन्य संभावित अनुप्रयोग श्वान कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक चूहों की उपलब्धता पर निर्भर करता है। दरअसल, एस 100-जीएफपी69 और पीएलपी-जीएफपी70 चूहों को विवो और / या श्वान कोशिकाओं के सीटू इमेजिंग में सक्षम बनाया गया है और परिधीय तंत्रिका उत्थान के दौरान श्वान सेल माइग्रेशन में शामिल अनुसंधान में सबसे आगे रहे हैं।
इन अनुप्रयोगों के अलावा और माइटो.सीएफपी माउस के पूरक कई ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की उपलब्धता है जो माइटोकॉन्ड्रिया और ऑटोफैगोसोम जैसे अलग-अलग ऑर्गेनेल में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं। उदाहरण के लिए, विवो माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन में जांच माइटो :: एमकेटीई 2 माउस71 या फोटोकनवर्टिबल माइटोडेंड्रा माउस57 के साथ संभव हो सकती है। इसके अलावा, विवो माइटोफैगोसोम परिवहन में पीएच-संवेदनशील माइटो-कीमा माउस72 और माइटोफैगी विश्लेषण के लिए माइटो-क्यूसी माउस73 का उपयोग करके संभव हो सकता है। इसके अलावा, हमारे द्वारा सामना की जाने वाली लाइसोसोमल लेबलिंग कठिनाइयों को लैंप 1-जीएफपी व्यक्त करने वाले चूहों का उपयोग करके दूर किया जा सकता है, इस चेतावनी के साथ कि एलएएमपी 1 लाइसोसोम74 से अलग एंडोसाइटिक ऑर्गेनेल में भी मौजूद है।
संक्षेप में, हमने विविध ट्रांसजेनिक चूहों से विशिष्ट परिधीय तंत्रिका अक्षतंतु में कई ऑर्गेनेल के विवो एक्सोनल परिवहन में आकलन करने के लिए उपन्यास तरीके प्रदान किए हैं। माइटोकॉन्ड्रिया और एंडोसोम75,76 जैसे ऑर्गेनेल के एक्सोनल इंटरैक्शन और सह-तस्करी के हालिया निष्कर्षों को देखते हुए विभिन्न ऑर्गेनेल की समवर्ती इमेजिंग विशेष रूप से महत्वपूर्ण होगी। हमारा मानना है कि प्रस्तुत विधियां विवो में अक्षतंतु के बेसल शरीर विज्ञान की समझ में सुधार करने और परिधीय तंत्रिकाओं के न्यूरोडीजेनेरेशन को चलाने वाले महत्वपूर्ण पैथोमैकेनिज्म को खोलने के लिए उपयोगी होंगी।
The authors have nothing to disclose.
ब्राउनस्टोन (क्वीन स्क्वायर इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजी, यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन) को एचबी 9 साझा करने के लिए चैट-ईजीएफपी, सीएचएटी.क्रे और रोसा 26.टीडीटोमैटो चूहों, और पिएत्रो फ्रैटा (क्वीन स्क्वायर इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजी, यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन) को साझा करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। जीएफपी माउस। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए ऐलेना आर राइम्स, शार्लोट जेपी क्रेमर्स और किउहान लैंग (क्वीन स्क्वायर इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजी, यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन) को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को मोटर न्यूरॉन रोग एसोसिएशन (यूके) (टोसोलिनी / अक्टूबर 20 / 973-799) (एपीटी), वेलकम ट्रस्ट सीनियर इन्वेस्टिगेटर अवार्ड्स (107116 / जेड / 15 / जेड और 223022 / जेड / 21 / जेड) (जीएस), यूके डिमेंशिया रिसर्च इंस्टीट्यूट फाउंडेशन अवार्ड (जीएस) से जूनियर नॉन-क्लिनिकल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था; और एक मेडिकल रिसर्च काउंसिल कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड (एमआर / एस 006990/1) (जेएनएस)।
0.2 mL PCR tube | |||
70% (v/v) ethanol in distilled water | |||
AlexaFlour555 C2 maleimide | ThermoFisher Scientific | A-20346 | Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide |
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J | Jackson Laboratory | 7909 | Rosa26.tdTomato mice |
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice | Jackson Laboratory | 5029 | HB9.GFP mice |
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice | Jackson Laboratory | 7967 | Mito.CFP mice |
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice | Jackson Laboratory | 6410 | ChAT.Cre mice |
Computer with microscope control and image acquisition software | Zeiss | Zen | |
Cotton swab | |||
Desktop centrifuge | |||
Dissecting microscope | |||
Eye lubricant | |||
Fine curved forceps | Dumont | ||
Fine straight forceps | Dumont | ||
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1) | |||
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
Hair clippers | |||
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) | Merck | 20779 | |
HcT-441 | N/A | N/A | See Restani et al., 2012 for more details |
Heating pad | |||
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C | |||
Inverted confocal microscope with environmental chamber | Zeiss | LSM 780 | Most inverted confocals should be adaptable |
Isoflurane | |||
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer | |||
Magic tape | invisible tape | ||
Micropipette puller | |||
Parafilm | Parafilm | ||
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4 | |||
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | BDNF that can be used to co-inject with HcT-555 |
Saline | |||
Scalpel blade | Dumont | ||
Small spring scissors | Dumont | ||
Surgery/operating microscope | |||
Surgical drape | |||
Surgical suture | |||
Surgical tape | |||
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice | MMRRC | 000296-UCD | ChAT.eGFP |
Vortex mixer |