تم تطبيق الإعطاء الفموي ل dsRNA الذي تنتجه البكتيريا ، وهي طريقة توصيل لتداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) التي تستخدم بشكل روتيني في Caenorhabditis elegans ، بنجاح هنا على البعوض البالغ. تسمح طريقتنا بإجراء دراسات قوية لعلم الوراثة العكسي ودراسات ناقلات منع انتقال العدوى دون استخدام الحقن.
كان تداخل الحمض النووي الريبي أداة تستخدم بكثافة للتحليل الجيني العكسي لمدة عقدين. في البعوض البالغ ، تم تنفيذ الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA) في المقام الأول عن طريق الحقن ، والذي يتطلب وقتا طويلا وغير مناسب للتطبيقات الميدانية. للتغلب على هذه القيود ، نقدم هنا طريقة أكثر كفاءة للتنشيط القوي للحمض النووي الريبي عن طريق التسليم الفموي ل dsRNA إلى Anopheles gambiae للبالغين. تم إنتاج dsRNAs طويلة في سلالة الإشريكية القولونية HT115 (DE3) ، وتم تقديم تعليق مركز للبكتيريا المحتوية على dsRNA المقتولة بالحرارة في 10٪ من السكروز على كرات القطن ad-libitum للبعوض البالغ. تم استبدال كرات القطن كل 2 أيام طوال مدة العلاج. أدى استخدام هذه الطريقة لاستهداف مزدوج الجنس (جين مشارك في التمايز بين الجنسين) أو رأس الشوكة (الذي يشفر عامل نسخ الغدة اللعابية) إلى انخفاض التعبير الجيني المستهدف و / أو إشارة التألق المناعي للبروتين ، كما تم قياسها بواسطة PCR الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) أو المجهر البؤري الفلوري ، على التوالي. كما لوحظت عيوب في مورفولوجيا الغدة اللعابية. يمكن أن تكون هذه الطريقة المرنة للغاية وسهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة والفعالة من حيث الوقت لتوصيل dsRNA قابلة للتطبيق على نطاق واسع على الجينات المستهدفة المهمة لفسيولوجيا ناقلات الحشرات وما بعدها.
تنتقل العديد من الأمراض عن طريق البعوض ، مما يجعل دراسة فسيولوجيا البعوض وعلم الوراثة مهمة مهمة. كان استخدام الحمض النووي الريبي في هذه الكائنات الحية بارزا في السنوات العشرين الماضية وسمح بالتوصيف الوظيفي للعديد من جينات البعوض1،2،3،4،5. كانت التقنية الأكثر استخداما لتوصيل dsRNA هي الحقن المجهري ، والذي له عيوب أنه يمكن أن يصيب البعوض ويتطلب وقتا وجهدا كبيرين. تم اختبار طرق التسليم عن طريق الفم ل RNAi ، ولكن بشكل رئيسي في مرحلة يرقات البعوض6،7،8،9. ولم يتم استكشاف التوصيل الفموي للحمض النووي الريبوزي المرسال عن طريق الفم في البعوض البالغ بشكل كامل ويمكن أن يكون أداة مفيدة لدراسة بيولوجيا النواقل ومكافحة النواقل.
تنتقل الملاريا عن طريق بعوض الأنوفيليس عندما تأخذ أنثى البعوضة المصابة وجبة دم من مضيف غير مصاب وتحقن اللعاب الذي يحتوي على طفيليات الملاريا10. لكي ينتقل الطفيلي في نهاية المطاف في لعاب البعوض ، يجب أن يتغلب على العديد من العقبات ، بما في ذلك التهرب من الجهاز المناعي للبعوض ، واجتياز حاجز الأمعاء الوسطى ، وغزو الغدد اللعابية11. تعد بنية الغدة اللعابية للبعوض (SG) مفتاحا لغزو الطفيليات ويتم التحكم في هذه البنية من خلال عوامل النسخ الرئيسية المعبر عنها في الغدة اللعابية وكذلك محددات إزدواج الشكل الجنسي. هناك حاجة إلى العديد من عوامل النسخ المحفوظة للغاية للمواصفات الخلوية والصيانة الاستتبابية للغدد اللعابية ولإنتاج وإفراز البروتينات اللعابية التي تعمل في تغذية الدم12،13،14. رأس الشوكة (Fkh) هو عامل نسخ حلزوني مجنح يعمل كمنظم رئيسي لبنية الحشرات SG ووظيفتها (استنادا إلى الدراسات التي أجريت على ذباب الفاكهة وعثة دودة القز)15،16،17،18،19،20. في SGs ذبابة الفاكهة ، يعمل Fkh مع Sage ، وهو عامل نسخ حلزوني حلزوني أساسي خاص ب SG (bHLH) ، لتعزيز بقاء SG وإنتاج اللعاب19. أحد المنظمين المشاركين المهمين والإيجابيين لإنتاج اللعاب في ذبابة الفاكهة هو CrebA ، وهو عامل نسخ سحاب الليوسين المدروس جيدا والذي ينظم التعبير عن جينات المسار الإفرازي21،22،23. هناك أيضا درجة قوية من التمايز المورفولوجي في الغدد اللعابية الأنثوية التي من المحتمل أن تلعب دورا رئيسيا ، ليس فقط في تغذية الدم ولكن أيضا في قدرة الطفيليات على غزو هذا النسيج24.
العديد من الجينات المشاركة في تحديد بقاء الغدة اللعابية ، والبنية ، وعلم وظائف الأعضاء ، وإزدواج الشكل الجنسي لها ملامح التعبير الزماني المكاني المعقدة25،26،27 ، وطرق التسليم التقليدية ل dsRNA لحث الحمض النووي الريبي ليست دائما فعالة في استهداف هذه الأنواع من الجينات في هذا النسيج أو غيره. ومع ذلك ، فقد تم استخدام التسليم الفموي ل dsRNA في مرحلة اليرقات الزاعجة المصرية والبعوض الغامبي بنجاح لإسكات الشكل الخاص بالإناث من جين dsx 9,28. وجدت الدراسات السابقة التي استخدمت dsRNA في الغدد اللعابية للبعوض أنه على الرغم من الحاجة إلى كميات كبيرة من dsRNA ، إلا أن تأثير إسكات الصوت كان طويل الأمد نسبيا (13 يوما على الأقل)29. هنا ، تم اختبار قدرة سلالة E. coli القاتلة بالحرارة HT115 (DE3) التي تعبر عن dsRNA الخاص بالتسلسل ل dsx أو fkh أو CrebA للحث على إسكات الحمض النووي الريبي لهذه الجينات في إناث البعوض البالغة. الإعطاء الفموي لل dsRNA الناجم عن ضربة قاضية للجين في An. gambiae ، مع تخفيضات واضحة في مستويات mRNA ومع الأنماط الظاهرية المتسقة مع فقدان وظيفة هذه الجينات. وبالتالي ، من المرجح أن يعمل هذا النهج على هدم وظيفة مجموعة متنوعة من جينات الغدة اللعابية.
إن القدرة على توصيل الحمض النووي الريبوزي المرسال بشكل فعال إلى البعوض الغامبي عن طريق التغذية الفموية لها آثار واسعة النطاق على دراسات بيولوجيا النواقل في المختبر وفي الميدان على حد سواء. منذ فترة طويلة تم قبول الحقن المجهري باعتباره الطريقة المفضلة لتوصيل المواد الكيميائية والأجسام المضادة والحمض النووي الريبي واستراتيجيات التعديل الوراثي في البعوض43,44. يمكن تجنب نتيجة التلاعب المادي الكبير ، والأضرار الخلوية ، والإجهاد عن طريق استخدام التسليم عن طريق الفم ، والتي يمكن أن تكون مناسبة أيضا للتطبيقات واسعة النطاق أو الميدانية. وقد اقترح العمل السابق أن الحمض النووي الريبي يعمل في كل مكان داخل البعوض البالغ الفرد29 ، مما يسمح بتأثيرات في جميع الأنسجة ، بما في ذلك الغدد اللعابية. من خلال إطعام البعوض بأعداد كبيرة من الإشريكية القولونية المعبرة عن dsRNA والتي يتم هضمها بشكل غير متزامن على مدى إطار زمني طويل ، يمكن للمرء أن يحقق تعرضا ثابتا وموحدا للحمض النووي الريبي عبر جميع الأفراد في قفص. تسمح هذه الطريقة بإطعام أعداد كبيرة من البعوض وتحليل التباين المحتمل للأنماط الظاهرية الناتجة اعتمادا على الجين المستهدف. ومع ذلك ، فإن أحد الاعتبارات المهمة هو إمكانية التوزيع غير المتجانس للبكتيريا ، وبالتالي dsRNA ، في ألياف القطن. تحتوي 400 ميكرولتر من البكتيريا المستخدمة يوميا لتغذية البعوض بالسكر على ما يقرب من 4.6 ≤ميكروغرام من dsRNA ، كما هو موضح ومحسوب سابقا9 ولكن كمية dsRNA التي يتناولها كل بعوض لم يتم تحديدها بشكل فردي. إذا أصبح بناء هياكل dsRNA أمرا روتينيا ، فإن بروتوكول العلاج البسيط هذا يسمح بالاستيعاب السريع لهذه التقنية من قبل أي باحث في البعوض. بداهة ، فإن الوقت الذي ينفقه العلاج (30 دقيقة في اليوم) تافه مقارنة بالوقت المستغرق للتعلم وتطبيق الحقن المجهري على أحجام عينات مماثلة.
يستخدم تغذية dsRNA بشكل روتيني لدراسات علم الوراثة العكسية في الكائن الحي النموذجي Caenorhabditis elegans45. ويؤكد هذا المستوى الثقيل من الاستخدام على قيمة نهج التسليم عن طريق الفم. إن بناء مكتبة على مستوى الجينوم على مستوى An. gambiae في الإشريكية القولونية المحولة ، على غرار تلك الموجودة في C. elegans46,47 ، سيسمح بإجراء فحص وراثي عكسي سريع في البعوض على نطاق متزايد. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن كفاءة الطريقة تعتمد إلى حد كبير على المستويات الداخلية للنسخ وإذا كان التعبير لا يقتصر على الأنسجة المستهدفة ولكن يتم التعبير عنه على نطاق أوسع 4,8,44. بالإضافة إلى ذلك ، هناك أدلة على أن بعض المبيدات الحشرية يمكن أن تحفز تجنب السلوك من البعوض48 ، والتغذية بالبكتيريا التي يحتمل أن تحفز الآثار الضارة فيها يمكن أن تؤدي إلى أنماط مماثلة من التجنب. في بيئة المختبر الخاضعة للرقابة ، حيث لم يكن لدى البعوض مصدر غذائي بديل ، لم يكن لديهم خيار لتجنب ماء السكر مع الإشريكية القولونية ، وربما تتجاوز الحاجة إلى مصدر مغذي غريزة تجنب البكتيريا. ومع ذلك ، ينبغي النظر في ذلك إذا كان من المفترض استخدام الاستراتيجية في إعدادات أقل تحكما فيها.
قد يكون من الممكن استهداف جينات متعددة في وقت واحد (باستخدام بنية واحدة أو تركيبات متعددة أو خليط من العزلات البكتيرية المتحولة) ، ولكن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتقييم الفعالية. وثمة اعتبار هام آخر لهذه النقطة هو تقييم الآثار المحتملة خارج الهدف أو الآثار التآزرية عند استخدام أهداف واحدة أو متعددة. يعد إنشاء جينات ومجموعات تحكم مناسبة جزءا مهما من التصميم التجريبي. علاوة على ذلك ، من المغري التكهن بأن هذا النهج يمكن استخدامه لاستهداف مسببات الأمراض أو الفيروسات الأخرى49. تم تنفيذ العمل السابق نحو تحريض الحمض النووي الريبي في البعوض في ظل ظروف تم فيها حقن الكاشف مباشرة ، لذلك لم تكن E. coli موجودة. قد توفر الإشريكية القولونية حجرة واقية تسمح بإطلاق أبطأ ل dsRNA بمرور الوقت ، مما يضمن أن التعرض مستمر إلى حد ما على مدى فترة أطول بكثير29.
وأخيرا، تظهر هذه النتائج أن آثار هذه التقنية قابلة للضبط عن طريق ضبط الإطار الزمني (الطول ويوم البدء) للتعرض وكمية الإشريكية القولونية المستخدمة. سمحت لنا هذه الميزة بدراسة وظائف الجينات الأساسية (dsx و fkh) من خلال تحديد ظروف الضربة القاضية المثلى عن طريق التجربة والخطأ. هذا يعزز إلى حد كبير من احتمال أن الجينات المستهدفة ذات الأهمية يمكن التحقيق فيها باستخدام هذه التقنية.
باختصار ، وجد أن توصيل الحمض النووي الريبي عن طريق الفم إلى البعوض البالغ يمكن أن يكون بسيطا ومتعدد الاستخدامات ونهجا قويا لدراسة وظيفة جين البعوض ولإنشاء أدوات جديدة ومرنة لمكافحة ناقلات الأمراض التي ينقلها البعوض.
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون أن يشكروا الموظفين والعلماء داخل فرع علم الحشرات وشعبة الأمراض الطفيلية والملاريا في مركز السيطرة على الأمراض ، وبراين تريغ وميشيل تشيو على المساعدة في إعداد البكتيريا في JHU و / أو المناقشات المفيدة لهذا العمل. نشكر JHMRI Insectary ومديرها كريس كيزيتو على الوصول إلى البعوض الغامبي وتربية البعوض الغامبي . نشكر وي هوانغ (JHSPH) على المساعدة في الحصول على البلازميدات PJet GFP و pPB47 GFP لاستخدامها في هذه الدراسة. وقدم التمويل لهذا العمل كل من: NIH R21AI153588 (إلى DJA)، وهي زمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هو ومن خلال منحة من مؤسسة Good Ventures ومشروع العمل الخيري المفتوح لمؤسسة CDC بعنوان دعم الحفظ بالتبريد وقمع نمو الإناث في البعوض للمساعدة في البحث عن الملاريا ، مشروع العمل الخيري المفتوح ، 2017. نحن نقدر تقديرا عميقا المساعدة المقدمة من موظفي مرفق المجهر JHU ودعم منحة المعاهد الوطنية للصحة المعمول به للمجهر المستخدم (NIH Grant #: S10OD016374). النتائج والاستنتاجات الواردة في هذه المخطوطة هي نتائج المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات نظر مركز السيطرة على الأمراض. استخدام الأسماء التجارية هو لتحديد الهوية فقط ولا يعني موافقة مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها أو خدمة الصحة العامة أو وزارة الصحة والخدمات الإنسانية الأمريكية.
1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | |
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium | BD Difco | DF0440-17 | |
AAPP | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo |
AccuStart II PCR Supermix | Quantabio | 95137-100 | |
Agarose | Millipore Sigma | A9539 | |
Ampicillin | Millipore Sigma | A5354 | |
Anopheles gambiae G3 | BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4) | MRA-112 | |
BugDorm | BioQuip | 1452 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | P022628181 | |
CrebA | DSHB | CrebA Rbt-PC | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
Damiens diet | BioServ | ||
DAPI | Life Technologies | n/a | 4′,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution. |
Defibrinated sheep blood | HemoStat | DSB050 | |
Escherichia coli HT115 (DE3) | |||
Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Millipore Sigma | I5502 | |
JM109 Competent cells | Promega | L2005 | |
Luria Broth Media | Thermo Fisher Scientific | 10855001 | |
Mucin 2 | Proteintech | Muc2; 27 675-1-AP | Antisera. 1:100 dilution (mouse). |
Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
Nile Red | Sigma | n/a | Lipid dye; 1:50 dilution. |
Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis | Thermo Fisher Scientific | Model B2 | |
pGEMT easy | Promega | A3600 | |
Power SYBR-green PCR master MIX | Applied Biosystems | 4367659 | |
PureLink PCR purification kit | Thermo Fisher Scientific | K31001 | |
QuantaStudio 6 | Applied Biosystems | ||
QuantStudio6 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
Rab11 | n/a | n/a | Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
Rh-WGA | Vector Labs | n/a | Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution |
Sage | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab |
T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
Tetracycline | Millipore Sigma | 87128 | |
Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope | Zeiss | ||
ANTIBODIES | |||
Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21472 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A28181 | |
IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27034 | |
Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27012 | |
PRIMERS | |||
ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC CGGA |
CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |