Summary

פלטפורמה גמישה לניטור למידה אסוציאטיבית חושית תלוית מוח הקטן

Published: January 19, 2022
doi:

Summary

פיתחנו פלטפורמה אחת למעקב אחר התנהגות בעלי חיים במהלך שתי משימות למידה אסוציאטיביות תלויות סיבים מטפסים. התכנון הזול מאפשר אינטגרציה עם ניסויים אופטוגנטיים או ניסויי הדמיה המכוונים לטיפוס על פעילות המוח הקטן הקשורה לסיבים תזונתיים.

Abstract

קלטי סיבים מטפסים לתאי Purkinje מספקים אותות מאלפים החיוניים ללמידה אסוציאטיבית תלוית המוח הקטן. חקר אותות אלה בעכברים בעלי ראש קבוע מקל על השימוש בשיטות הדמיה, אלקטרופיזיולוגיות ואופטוגנטיות. כאן פותחה פלטפורמה התנהגותית בעלות נמוכה (כ-1,000 דולר) המאפשרת מעקב אחר למידה אסוציאטיבית בעכברים מקובעי ראש שמסתובבים בחופשיות על גלגל רץ. הפלטפורמה משלבת שתי פרדיגמות למידה אסוציאטיביות נפוצות: התניית מצמוץ עיניים והתניה מושהית של מבהיל מישוש מושהה. ההתנהגות נמצאת במעקב באמצעות מצלמה ותנועת הגלגלים על ידי גלאי. אנו מתארים את הרכיבים וההתקנה ומספקים פרוטוקול מפורט להדרכה ולניתוח נתונים. פלטפורמה זו מאפשרת שילוב של גירוי אופטוגנטי והדמיה פלואורסצנטית. התכנון מאפשר למחשב מארח יחיד לשלוט בפלטפורמות מרובות לאילוף בעלי חיים מרובים בו זמנית.

Introduction

התניה פבלובית של קשר תת-שני בין גירויים כדי לעורר תגובה מותנית שימשה זה מכבר כדי לחקור למידה התלויה במוח הקטן. לדוגמה, במיזוג עפעפיים קלאסי מושהה (DEC), בעלי חיים לומדים לבצע מצמוץ מגן מתוזמן היטב בתגובה לגירוי מותנה נייטרלי (CS; למשל, הבזק של אור או צליל שמיעתי) כאשר הוא מזווג שוב ושוב עם גירוי בלתי מותנה (US; למשל, נפיחות של אוויר המופעל על הקרנית) אשר תמיד מעורר מצמוץ רפלקס, ואשר מגיע בסוף ה-CS או בסמוך לו. התגובה המלומדת מכונה תגובה מותנית (CR), בעוד שתגובת הרפלקס מכונה התגובה הבלתי מותנית (UR). בארנבים, נגעים ספציפיים למוח הקטן משבשים צורה זו של למידה 1,2,3,4. יתר על כן, קוצים מורכבים של תאי Purkinje, המונעים על ידי קלט הסיבים המטפסים שלהם5, מספקים אותהכרחי של 6,7 ומספיק 8,9 לרכישת CRs מתוזמנים כראוי.

לאחרונה פותחו פרדיגמות למידה אסוציאטיביות תלויות סיבים מטפסים עבור עכברים קבועים ראש. DEC הייתה פרדיגמת הלמידה האסוציאטיבית הראשונה שהותאמה לתצורה זו10,11. DEC בעכברים קבועים ראש שימש לזיהוי אזורים במוחהקטן 11,12,13,14,15,16,17 ורכיבי מעגל11,1 2,13,14,15,18,19 הנדרשים לצורך השגת משימות והכחדתן. גישה זו שימשה גם כדי להדגים כיצד הייצוג הפיזיולוגי ברמה התאית של פרמטרי משימה מתפתח עםלמידה של 13,15,16.

בנוסף ל-eyeblink, פרדיגמת התניית המישוש המושהה (DTSC) פותחה לאחרונה כמטלת למידה אסוציאטיבית חדשנית עבור עכברים קבועים ראש20. בדומה מבחינה רעיונית ל-DEC, DTSC כולל הצגה של CS נייטרלי עם US, הקשה על הפנים בעוצמה מספקת כדי להפעיל רפלקס מבהיל 21,22 כ-UR. בפרדיגמה של DTSC, הן ה-UR והן ה-CR נקראים כתנועה לאחור על גלגל. DTSC שימש כעת כדי לחשוף כיצד למידה אסוציאטיבית משנה את פעילות המוח הקטן ואת דפוסי הביטוי של גנים20.

בעבודה זו פותחה שיטה ליישום גמיש של DEC או DTSC בפלטפורמה אחת. תכונות הגירוי והפלטפורמה עוברות מיפוי באיור 1. העיצוב משלב את היכולת לעקוב אחר התנהגות בעלי חיים באמצעות מצלמה, כמו גם מקודד סיבובי למעקב אחר תנועת עכבר על גלגל. כל ההיבטים של רישום נתונים ומבנה הניסוי נשלטים על ידי מיקרו-בקרים מזווגים (Arduino) ומחשב בעל לוח יחיד (SBC; פטל פאי). ניתן לגשת להתקנים אלה באמצעות ממשק משתמש גרפי מסופק. כאן אנו מציגים זרימת עבודה להתקנה, הכנה וביצוע של ניסויים, וצינור ניתוח מותאם אישית להדמיית נתונים.

Protocol

הפרוטוקולים של בעלי החיים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם של אוניברסיטת פרינסטון. 1. הקמת ה-SBC חבר את כבל הממשק הטורי של המצלמה (CSI) למצלמת Raspberry NoIR V2 וליציאת המצלמה ב- SBC. הורד את מערכת ההפעלה עבור SBC למחשב המארח. כתוב את תמונת ?…

Representative Results

זרימת עבודה לניסויים וניתוחים של DECבחירת פרמטרים ניסיונית נכונה חשובה לאימון מוצלח של התניית לינק עין (DEC). עבור הנתונים שהוצגו כאן, ממשק המשתמש הגרפי שימש לבחירת משך CS של 350 אלפיות השנייה ומשך ארה”ב של 50 אלפיות השנייה. זיווג זה גורם למרווח בין גירויים של 300 אלפיות השנייה: ארוך מספ?…

Discussion

הפלטפורמה עם הפרוטוקולים המשויכים המתוארים כאן יכולה לשמש למעקב אמין אחר התנהגות בעלי חיים בשתי משימות למידה אסוציאטיביות חושיות. כל משימה תלויה בתקשורת שלמה דרך מסלול הסיבים המטפס. בתכנון המתואר כאן, אנו משלבים אלמנטים כדי להקל על למידה ורישום / הפרעה של תגובת המוח הקטן. אלה כוללים גלגל ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות הנפש NRSA F32 MH120887-03 (ל- G.J.B.) ו- R01 NS045193 ו- R01 MH115750 (ל- S.S-H.W.). אנו מודים לד”ר באס קוקקוק והנק-יאן בולה על דיונים מועילים לאופטימיזציה של הגדרת ה- DEC ולד”ר יו וואנג ושיאואינג צ’ן על דיונים מועילים לאופטימיזציה של הגדרת ה- DTSC.

Materials

"B" Quick Base For C&B METABOND – 10 mL bottle Parkell S398 Dental cement solvent
"C" Universal TBB Catalyst – 0.7 mL Parkell S371 Catalyst
#8 Washers Thorlabs W8S038 Washers
0.250" (1/4") x 8.00" Stainless Steel Precision Shafting Servocity 634172 1/4" shaft
0.250” (0.770") Clamping Hub Servocity 545588 Clamping hub
1/4" to 6 mm Set Screw Shaft Coupler- 5 pack Actobotics 625106 Shaft-coupling sleeve
1/4"-20 Cap Screws, 3/4" Long Thorlabs SH25S075 1/4" bolt
100 pcs 5 mm 395–400 nm UV Ultraviolet LED Light Emitting Diode Clear Round Lens 29 mm Long Lead (DC 3V) LEDs Lights +100 pcs Resistors EDGELEC ‎ED_YT05_U_100Pcs CS LEDs
2 m Micro HDMI to DVI-D Cable – M/M – 2 m Micro HDMI to DVI Cable – 19 pin HDMI (D) Male to DVI-D Male – 1920 x 1200 Video Star-tech ‎HDDDVIMM2M Raspberry Pi4B to monitor cable
256 GB Ultra Fit USB 3.1 Flash Drive SanDisk ‎SDCZ430-256G-G46 USB thumb drive
3.3 V–5 V 4 Channels Logic Level Converter Bi-Directional Shifter Module Amazon B00ZC6B8VM Logic level shifter
32 GB 95 MB/s (U1) microSDHC EVO Select Memory Card Samsung ‎MB-ME32GA/AM microSD card
4.50" Aluminum Channel Servocity 585444 4.5" aluminum channel
48-LED CCTV Ir Infrared Night Vision Illuminator Towallmark SODIAL Infrared light array
4PCS Breadboards Kit Include 2PCS 830 Point 2PCS 400 Point Solderless Breadboards for Proto Shield Distribution Connecting Blocks REXQualis B07DL13RZH Breadboard
5 Port Gigabit Unmanaged Ethernet Network Switch TP-Link ‎TL-SG105 Ethernet switch
5 V 2.5 A Raspberry Pi 3 B+ Power Supply/Adapter Canakit ‎DCAR-RSP-2A5 Power supply for Raspberry Pi 3B+
5-0 ETHILON BLACK 1 x 18" C-3 Ethicon 668G Sutures
6 mm Shaft Encoder 2000 PPR Pushpull Line Driver Universal Output Line Driver Output 5-26 V dc Supply Calt  B01EWER68I Rotary encoder
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 1", 5 Pack Thorlabs TR1-P5 Optical posts
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack Thorlabs TR2-P5 Optical posts
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 4", 5 Pack Thorlabs TR4-P5 Optical posts
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 6", 5 Pack Thorlabs TR6-P5 Optical posts
Ø1/2" Post Holder, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 2" Thorlabs PH2 Optical post holder
Adapter-062-M X LUER LOCK-F The Lee Co. TMRA3201950Z Solenoid valve luer adapter
Aeromat Foam Roller Size: 36" Length Aeromat B002H3CMUE Foam roller
Aluminum Breadboard 10" x 12" x 1/2", 1/4"-20 Taps Thorlabs MB1012 Aluminum breadboard
Amazon Basics HDMI to DVI Adapter Cable, Black, 6 Feet, 1-Pack Amazon HL-007347 Raspberry Pi3B+ to monitor cable
Arduino  Uno R3 Arduino A000066 Arduino Uno (microcontroller board)
Arduino Due Arduino ‎A000062 Arduino Due (microcontroller board)
Bench Power Supply, Single, Adjustable, 3 Output, 0 V, 24 V, 0 A, 2 A Tenma 72-8335A Power supply
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet, 12" x 24" x 1/8" McMaster Carr 8560K257 Acrylic sheet
CNC Stepper Motor Driver 1.0–4.2 A 20–50 V DC 1/128 Micro-Step Resolutions for Nema 17 and 23 Stepper Motor Stepper Online B06Y5VPSFN Stepper motor driver
Compact Compressed Air Regulator, Inline Relieving, Brass Housing, 1/4 NPT McMaster Carr 6763K13 Air source regulator
Cotton Swab Puritan 806-WC Cotton swab
Dell 1908FP 19" Flat Panel Monitor – 1908FPC Dell 1908FPC Computer monitor
Flex Cable for Raspberry Pi Camera Adafruit 2144 camera serial interface cable
High Torque Nema 17 Bipolar Stepper Motor 92 oz·in/65 N·cm 2.1 A Extruder Motor Stepper Online 17HS24-2104S Stepper motor
Isoflurane Henry Schein 66794001725 Isoflurane
Krazy Maximum Bond Permanent Glue, 0.18 oz. Krazy Glue KG483 Cyanoacrylate glue
Lidocaine HCl VetOne 510212 Lidocaine
Low-Strength Steel Hex Nut, Grade 2, Zinc-Plated, 1/4"-20 Thread Size McMaster Carr 90473A029 Nuts
M3 x 50 mm Partially Threaded Hex Key Socket Cap Head Screws 10 pcs Uxcell A16040100ux1380 M3 bolt
NEMA 17 Stepper Motor Mount ACTOBOTICS 555152 Stepper motor mount
Official Raspberry Pi Power Supply 5.1 V 3 A with USB C – 1.5 m long Adafruit 4298 Power supply for Raspberry Pi 4B
Optixcare Dog & Cat Eye Lube Lubricating Gel, 0.70-oz tube Optixcare 142422 Opthalimic ointment
Precision Stainless Steel Ball Bearing, Shielded, Trade No. R188-2Z, 13000 rpm Maximum Speed McMaster-Carr 3759T57 Bearing
Premium Female/Female Jumper Wires – 40 x 6" Adafruit 266 Wires
Premium Female/Male 'Extension' Jumper Wires – 40 x 6" (150 mm) Adafruit 826 Wires
Premium Male/Male Jumper Wires – 40 x 6" Adafruit 758 Wires
Radiopaque L-Powder for C&B METABOND – 5 g Parkell S396 Dental cement powder
Raspberry Pi (3B+ or 4B) Adafruit 3775 or 4295 Raspberry Pi
Raspberry Pi NoIR Camera Module V2 – 8MP 1080P30 Raspberry Pi Foundation RPI3-NOIR-V2 Raspberry NoIR V2 camera
Right-Angle Bracket, 1/4" (M6) Counterbored Slot, 8-32 Taps Thorlabs AB90E Right-angle bracket
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 3/16" Hex Thorlabs RA90 Right-angle optical post clamp
Right-Angle End Clamp for Ø1/2" Posts, 1/4"-20 Stud and 3/16" Hex Thorlabs RA180 Right-angle end clamp
RJ45 Cat-6 Ethernet Patch Internet Cable Amazon ‎CAT6-7FT-5P-BLUE Ethernet cable
Rotating Clamp for Ø1/2" Posts, 360° Continuously Adjustable, 3/16" Hex Thorlabs SWC Rotating optical post clamps
Spike & Hold Driver-0.1 TO 5 MS The Lee Co. IECX0501350A Solenoid valve driver
Swivel Base Adapter Thorlabs UPHA Post holder adapter
USB 2.0 A-Male to Micro B Cable, 6 feet Amazon ‎7T9MV4 USB2 type A to USB2 micro cable
USB 2.0 Printer Cable – A-Male to B-Male, 6 Feet (1.8 m) Amazon B072L34SZS USB2 type B to USB2 type A cable
VHS-M/SP-12 V The Lee Co. INKX0514900A Solenoid valve
Zinc-Plated Steel 1/4" washer, OD 1.000" McMaster Carr 91090A108 Washers

References

  1. McCormick, D. A., Lavond, D. G., Clark, G. A., Kettner, R. E., Rising, C. E., Thompson, R. F. The engram found? Role of the cerebellum in classical conditioning of nictitating membrane and eyelid responses. Bulletin of the Psychonomic Society. 18 (3), 103-105 (1981).
  2. McCormick, D. A., Clark, G. A., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Initial localization of the memory trace for a basic form of learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (8), 2731-2735 (1982).
  3. McCormick, D. A., Thompson, R. F. Cerebellum: essential involvement in the classically conditioned eyelid response. Science. 223 (4633), 296-299 (1984).
  4. Krupa, D. J., Thompson, J. K., Thompson, R. F. Localization of a memory trace in the mammalian brain. Science. 260 (5110), 989-991 (1993).
  5. Llinás, R., Sugimori, M. Electrophysiological properties of in vitro Purkinje cell dendrites in mammalian cerebellar slices. The Journal of Physiology. 305, 197-213 (1980).
  6. Mintz, M., Lavond, D. G., Zhang, A. A., Yun, Y., Thompson, R. F. Unilateral inferior olive NMDA lesion leads to unilateral deficit in acquisition and retention of eyelid classical conditioning. Behavioral and Neural Biology. 61 (3), 218-224 (1994).
  7. Welsh, J. P., Harvey, J. A. Cerebellar lesions and the nictitating membrane reflex: performance deficits of the conditioned and unconditioned response. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 9 (1), 299-311 (1989).
  8. Mauk, M. D., Steinmetz, J. E., Thompson, R. F. Classical conditioning using stimulation of the inferior olive as the unconditioned stimulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (14), 5349-5353 (1986).
  9. Steinmetz, J. E., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Classical conditioning in rabbits using pontine nucleus stimulation as a conditioned stimulus and inferior olive stimulation as an unconditioned stimulus. Synapse. 3 (3), 225-233 (1989).
  10. Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: The role of movement oscillations in eyelid conditioning. Frontiers in Integrative Neuroscience. 5, 72 (2011).
  11. Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-dependent expression of motor learning during eyeblink conditioning in head-fixed mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14845-14853 (2014).
  12. Heiney, S. A., Kim, J., Augustine, G. J., Medina, J. F. Precise control of movement kinematics by optogenetic inhibition of purkinje cell activity. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2321-2330 (2014).
  13. Ten Brinke, M. M., et al. Evolving models of pavlovian conditioning: Cerebellar cortical dynamics in awake behaving mice. Cell Reports. 13 (9), 1977-1988 (2015).
  14. Gao, Z., et al. Excitatory cerebellar nucleocortical circuit provides internal amplification during associative conditioning. Neuron. 89 (3), 645-657 (2016).
  15. Giovannucci, A., et al. Cerebellar granule cells acquire a widespread predictive feedback signal during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (5), 727-734 (2017).
  16. Ten Brinke, M. M., et al. Dynamic modulation of activity in cerebellar nuclei neurons during pavlovian eyeblink conditioning in mice. eLife. 6, 28132 (2017).
  17. Wang, X., Yu, S., Ren, Z., De Zeeuw, C. I., Gao, Z. A FN-MdV pathway and its role in cerebellar multimodular control of sensorimotor behavior. Nature Communications. 11 (1), 6050 (2020).
  18. Albergaria, C., Silva, N. T., Pritchett, D. L., Carey, M. R. Locomotor activity modulates associative learning in mouse cerebellum. Nature Neuroscience. 21 (5), 725-735 (2018).
  19. Kim, O. A., Ohmae, S., Medina, J. F. A cerebello-olivary signal for negative prediction error is sufficient to cause extinction of associative motor learning. Nature Neuroscience. 23 (12), 1550-1554 (2020).
  20. Yamada, T., et al. Sensory experience remodels genome architecture in neural circuit to drive motor learning. Nature. 569 (7758), 708-713 (2019).
  21. Horlington, M. Startle response circadian rhythm in rats: lack of correlation with motor activity. Physiology & Behavior. 5 (1), 49-53 (1970).
  22. Yeomans, J. S., Li, L., Scott, B. W., Frankland, P. W. Tactile, acoustic and vestibular systems sum to elicit the startle reflex. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 26 (1), 1-11 (2002).
  23. . Raspberry Pi Operating system images Available from: https://www.raspberrypi.com/software/operationg-systems/ (2021)
  24. . VNC Server. VNC® Connect Available from: https://www.realvnc.com/en/connect/download/vnc/ (2021)
  25. . Anaconda: The world’s most popular data science platform Available from: https://xddebuganaconda.xdlab.co/ (2021)
  26. De Zeeuw, C. I., Ten Brinke, M. M. Motor learning and the cerebellum. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 021683 (2015).
  27. Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
  28. Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. Journal of Neurophysiology. 88 (4), 2124-2133 (2002).
  29. Kloth, A. D., et al. Cerebellar associative sensory learning defects in five mouse autism models. eLife. 4, 06085 (2015).
  30. Boele, H. -. J., Koekkoek, S. K. E., De Zeeuw, C. I. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 3, (2010).
  31. Lin, C., Disterhoft, J., Weiss, C. Whisker-signaled eyeblink classical conditioning in head-fixed Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53310 (2016).
  32. Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
  33. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).

Play Video

Cite This Article
Broussard, G. J., Kislin, M., Jung, C., Wang, S. S. -. A Flexible Platform for Monitoring Cerebellum-Dependent Sensory Associative Learning. J. Vis. Exp. (179), e63205, doi:10.3791/63205 (2022).

View Video