פלטפורמה גמישה לניטור למידה אסוציאטיבית חושית תלוית מוח הקטן
Summary
פיתחנו פלטפורמה אחת למעקב אחר התנהגות בעלי חיים במהלך שתי משימות למידה אסוציאטיביות תלויות סיבים מטפסים. התכנון הזול מאפשר אינטגרציה עם ניסויים אופטוגנטיים או ניסויי הדמיה המכוונים לטיפוס על פעילות המוח הקטן הקשורה לסיבים תזונתיים.
Abstract
קלטי סיבים מטפסים לתאי Purkinje מספקים אותות מאלפים החיוניים ללמידה אסוציאטיבית תלוית המוח הקטן. חקר אותות אלה בעכברים בעלי ראש קבוע מקל על השימוש בשיטות הדמיה, אלקטרופיזיולוגיות ואופטוגנטיות. כאן פותחה פלטפורמה התנהגותית בעלות נמוכה (כ-1,000 דולר) המאפשרת מעקב אחר למידה אסוציאטיבית בעכברים מקובעי ראש שמסתובבים בחופשיות על גלגל רץ. הפלטפורמה משלבת שתי פרדיגמות למידה אסוציאטיביות נפוצות: התניית מצמוץ עיניים והתניה מושהית של מבהיל מישוש מושהה. ההתנהגות נמצאת במעקב באמצעות מצלמה ותנועת הגלגלים על ידי גלאי. אנו מתארים את הרכיבים וההתקנה ומספקים פרוטוקול מפורט להדרכה ולניתוח נתונים. פלטפורמה זו מאפשרת שילוב של גירוי אופטוגנטי והדמיה פלואורסצנטית. התכנון מאפשר למחשב מארח יחיד לשלוט בפלטפורמות מרובות לאילוף בעלי חיים מרובים בו זמנית.
Introduction
התניה פבלובית של קשר תת-שני בין גירויים כדי לעורר תגובה מותנית שימשה זה מכבר כדי לחקור למידה התלויה במוח הקטן. לדוגמה, במיזוג עפעפיים קלאסי מושהה (DEC), בעלי חיים לומדים לבצע מצמוץ מגן מתוזמן היטב בתגובה לגירוי מותנה נייטרלי (CS; למשל, הבזק של אור או צליל שמיעתי) כאשר הוא מזווג שוב ושוב עם גירוי בלתי מותנה (US; למשל, נפיחות של אוויר המופעל על הקרנית) אשר תמיד מעורר מצמוץ רפלקס, ואשר מגיע בסוף ה-CS או בסמוך לו. התגובה המלומדת מכונה תגובה מותנית (CR), בעוד שתגובת הרפלקס מכונה התגובה הבלתי מותנית (UR). בארנבים, נגעים ספציפיים למוח הקטן משבשים צורה זו של למידה 1,2,3,4. יתר על כן, קוצים מורכבים של תאי Purkinje, המונעים על ידי קלט הסיבים המטפסים שלהם5, מספקים אותהכרחי של 6,7 ומספיק 8,9 לרכישת CRs מתוזמנים כראוי.
לאחרונה פותחו פרדיגמות למידה אסוציאטיביות תלויות סיבים מטפסים עבור עכברים קבועים ראש. DEC הייתה פרדיגמת הלמידה האסוציאטיבית הראשונה שהותאמה לתצורה זו10,11. DEC בעכברים קבועים ראש שימש לזיהוי אזורים במוחהקטן 11,12,13,14,15,16,17 ורכיבי מעגל11,1 2,13,14,15,18,19 הנדרשים לצורך השגת משימות והכחדתן. גישה זו שימשה גם כדי להדגים כיצד הייצוג הפיזיולוגי ברמה התאית של פרמטרי משימה מתפתח עםלמידה של 13,15,16.
בנוסף ל-eyeblink, פרדיגמת התניית המישוש המושהה (DTSC) פותחה לאחרונה כמטלת למידה אסוציאטיבית חדשנית עבור עכברים קבועים ראש20. בדומה מבחינה רעיונית ל-DEC, DTSC כולל הצגה של CS נייטרלי עם US, הקשה על הפנים בעוצמה מספקת כדי להפעיל רפלקס מבהיל 21,22 כ-UR. בפרדיגמה של DTSC, הן ה-UR והן ה-CR נקראים כתנועה לאחור על גלגל. DTSC שימש כעת כדי לחשוף כיצד למידה אסוציאטיבית משנה את פעילות המוח הקטן ואת דפוסי הביטוי של גנים20.
בעבודה זו פותחה שיטה ליישום גמיש של DEC או DTSC בפלטפורמה אחת. תכונות הגירוי והפלטפורמה עוברות מיפוי באיור 1. העיצוב משלב את היכולת לעקוב אחר התנהגות בעלי חיים באמצעות מצלמה, כמו גם מקודד סיבובי למעקב אחר תנועת עכבר על גלגל. כל ההיבטים של רישום נתונים ומבנה הניסוי נשלטים על ידי מיקרו-בקרים מזווגים (Arduino) ומחשב בעל לוח יחיד (SBC; פטל פאי). ניתן לגשת להתקנים אלה באמצעות ממשק משתמש גרפי מסופק. כאן אנו מציגים זרימת עבודה להתקנה, הכנה וביצוע של ניסויים, וצינור ניתוח מותאם אישית להדמיית נתונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפלטפורמה עם הפרוטוקולים המשויכים המתוארים כאן יכולה לשמש למעקב אמין אחר התנהגות בעלי חיים בשתי משימות למידה אסוציאטיביות חושיות. כל משימה תלויה בתקשורת שלמה דרך מסלול הסיבים המטפס. בתכנון המתואר כאן, אנו משלבים אלמנטים כדי להקל על למידה ורישום / הפרעה של תגובת המוח הקטן. אלה כוללים גלגל ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות הנפש NRSA F32 MH120887-03 (ל- G.J.B.) ו- R01 NS045193 ו- R01 MH115750 (ל- S.S-H.W.). אנו מודים לד”ר באס קוקקוק והנק-יאן בולה על דיונים מועילים לאופטימיזציה של הגדרת ה- DEC ולד”ר יו וואנג ושיאואינג צ’ן על דיונים מועילים לאופטימיזציה של הגדרת ה- DTSC.
Materials
| "B" Quick Base For C&B METABOND – 10 mL bottle | Parkell | S398 | Dental cement solvent |
| "C" Universal TBB Catalyst – 0.7 mL | Parkell | S371 | Catalyst |
| #8 Washers | Thorlabs | W8S038 | Washers |
| 0.250" (1/4") x 8.00" Stainless Steel Precision Shafting | Servocity | 634172 | 1/4" shaft |
| 0.250” (0.770") Clamping Hub | Servocity | 545588 | Clamping hub |
| 1/4" to 6 mm Set Screw Shaft Coupler- 5 pack | Actobotics | 625106 | Shaft-coupling sleeve |
| 1/4"-20 Cap Screws, 3/4" Long | Thorlabs | SH25S075 | 1/4" bolt |
| 100 pcs 5 mm 395–400 nm UV Ultraviolet LED Light Emitting Diode Clear Round Lens 29 mm Long Lead (DC 3V) LEDs Lights +100 pcs Resistors | EDGELEC | ED_YT05_U_100Pcs | CS LEDs |
| 2 m Micro HDMI to DVI-D Cable – M/M – 2 m Micro HDMI to DVI Cable – 19 pin HDMI (D) Male to DVI-D Male – 1920 x 1200 Video | Star-tech | HDDDVIMM2M | Raspberry Pi4B to monitor cable |
| 256 GB Ultra Fit USB 3.1 Flash Drive | SanDisk | SDCZ430-256G-G46 | USB thumb drive |
| 3.3 V–5 V 4 Channels Logic Level Converter Bi-Directional Shifter Module | Amazon | B00ZC6B8VM | Logic level shifter |
| 32 GB 95 MB/s (U1) microSDHC EVO Select Memory Card | Samsung | MB-ME32GA/AM | microSD card |
| 4.50" Aluminum Channel | Servocity | 585444 | 4.5" aluminum channel |
| 48-LED CCTV Ir Infrared Night Vision Illuminator | Towallmark | SODIAL | Infrared light array |
| 4PCS Breadboards Kit Include 2PCS 830 Point 2PCS 400 Point Solderless Breadboards for Proto Shield Distribution Connecting Blocks | REXQualis | B07DL13RZH | Breadboard |
| 5 Port Gigabit Unmanaged Ethernet Network Switch | TP-Link | TL-SG105 | Ethernet switch |
| 5 V 2.5 A Raspberry Pi 3 B+ Power Supply/Adapter | Canakit | DCAR-RSP-2A5 | Power supply for Raspberry Pi 3B+ |
| 5-0 ETHILON BLACK 1 x 18" C-3 | Ethicon | 668G | Sutures |
| 6 mm Shaft Encoder 2000 PPR Pushpull Line Driver Universal Output Line Driver Output 5-26 V dc Supply | Calt | B01EWER68I | Rotary encoder |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 1", 5 Pack | Thorlabs | TR1-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | Thorlabs | TR2-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 4", 5 Pack | Thorlabs | TR4-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 6", 5 Pack | Thorlabs | TR6-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Post Holder, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 2" | Thorlabs | PH2 | Optical post holder |
| Adapter-062-M X LUER LOCK-F | The Lee Co. | TMRA3201950Z | Solenoid valve luer adapter |
| Aeromat Foam Roller Size: 36" Length | Aeromat | B002H3CMUE | Foam roller |
| Aluminum Breadboard 10" x 12" x 1/2", 1/4"-20 Taps | Thorlabs | MB1012 | Aluminum breadboard |
| Amazon Basics HDMI to DVI Adapter Cable, Black, 6 Feet, 1-Pack | Amazon | HL-007347 | Raspberry Pi3B+ to monitor cable |
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | Arduino Uno (microcontroller board) |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Arduino Due (microcontroller board) |
| Bench Power Supply, Single, Adjustable, 3 Output, 0 V, 24 V, 0 A, 2 A | Tenma | 72-8335A | Power supply |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet, 12" x 24" x 1/8" | McMaster Carr | 8560K257 | Acrylic sheet |
| CNC Stepper Motor Driver 1.0–4.2 A 20–50 V DC 1/128 Micro-Step Resolutions for Nema 17 and 23 Stepper Motor | Stepper Online | B06Y5VPSFN | Stepper motor driver |
| Compact Compressed Air Regulator, Inline Relieving, Brass Housing, 1/4 NPT | McMaster Carr | 6763K13 | Air source regulator |
| Cotton Swab | Puritan | 806-WC | Cotton swab |
| Dell 1908FP 19" Flat Panel Monitor – 1908FPC | Dell | 1908FPC | Computer monitor |
| Flex Cable for Raspberry Pi Camera | Adafruit | 2144 | camera serial interface cable |
| High Torque Nema 17 Bipolar Stepper Motor 92 oz·in/65 N·cm 2.1 A Extruder Motor | Stepper Online | 17HS24-2104S | Stepper motor |
| Isoflurane | Henry Schein | 66794001725 | Isoflurane |
| Krazy Maximum Bond Permanent Glue, 0.18 oz. | Krazy Glue | KG483 | Cyanoacrylate glue |
| Lidocaine HCl | VetOne | 510212 | Lidocaine |
| Low-Strength Steel Hex Nut, Grade 2, Zinc-Plated, 1/4"-20 Thread Size | McMaster Carr | 90473A029 | Nuts |
| M3 x 50 mm Partially Threaded Hex Key Socket Cap Head Screws 10 pcs | Uxcell | A16040100ux1380 | M3 bolt |
| NEMA 17 Stepper Motor Mount | ACTOBOTICS | 555152 | Stepper motor mount |
| Official Raspberry Pi Power Supply 5.1 V 3 A with USB C – 1.5 m long | Adafruit | 4298 | Power supply for Raspberry Pi 4B |
| Optixcare Dog & Cat Eye Lube Lubricating Gel, 0.70-oz tube | Optixcare | 142422 | Opthalimic ointment |
| Precision Stainless Steel Ball Bearing, Shielded, Trade No. R188-2Z, 13000 rpm Maximum Speed | McMaster-Carr | 3759T57 | Bearing |
| Premium Female/Female Jumper Wires – 40 x 6" | Adafruit | 266 | Wires |
| Premium Female/Male 'Extension' Jumper Wires – 40 x 6" (150 mm) | Adafruit | 826 | Wires |
| Premium Male/Male Jumper Wires – 40 x 6" | Adafruit | 758 | Wires |
| Radiopaque L-Powder for C&B METABOND – 5 g | Parkell | S396 | Dental cement powder |
| Raspberry Pi (3B+ or 4B) | Adafruit | 3775 or 4295 | Raspberry Pi |
| Raspberry Pi NoIR Camera Module V2 – 8MP 1080P30 | Raspberry Pi Foundation | RPI3-NOIR-V2 | Raspberry NoIR V2 camera |
| Right-Angle Bracket, 1/4" (M6) Counterbored Slot, 8-32 Taps | Thorlabs | AB90E | Right-angle bracket |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 3/16" Hex | Thorlabs | RA90 | Right-angle optical post clamp |
| Right-Angle End Clamp for Ø1/2" Posts, 1/4"-20 Stud and 3/16" Hex | Thorlabs | RA180 | Right-angle end clamp |
| RJ45 Cat-6 Ethernet Patch Internet Cable | Amazon | CAT6-7FT-5P-BLUE | Ethernet cable |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Posts, 360° Continuously Adjustable, 3/16" Hex | Thorlabs | SWC | Rotating optical post clamps |
| Spike & Hold Driver-0.1 TO 5 MS | The Lee Co. | IECX0501350A | Solenoid valve driver |
| Swivel Base Adapter | Thorlabs | UPHA | Post holder adapter |
| USB 2.0 A-Male to Micro B Cable, 6 feet | Amazon | 7T9MV4 | USB2 type A to USB2 micro cable |
| USB 2.0 Printer Cable – A-Male to B-Male, 6 Feet (1.8 m) | Amazon | B072L34SZS | USB2 type B to USB2 type A cable |
| VHS-M/SP-12 V | The Lee Co. | INKX0514900A | Solenoid valve |
| Zinc-Plated Steel 1/4" washer, OD 1.000" | McMaster Carr | 91090A108 | Washers |
References
- McCormick, D. A., Lavond, D. G., Clark, G. A., Kettner, R. E., Rising, C. E., Thompson, R. F. The engram found? Role of the cerebellum in classical conditioning of nictitating membrane and eyelid responses. Bulletin of the Psychonomic Society. 18 (3), 103-105 (1981).
- McCormick, D. A., Clark, G. A., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Initial localization of the memory trace for a basic form of learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (8), 2731-2735 (1982).
- McCormick, D. A., Thompson, R. F. Cerebellum: essential involvement in the classically conditioned eyelid response. Science. 223 (4633), 296-299 (1984).
- Krupa, D. J., Thompson, J. K., Thompson, R. F. Localization of a memory trace in the mammalian brain. Science. 260 (5110), 989-991 (1993).
- Llinás, R., Sugimori, M. Electrophysiological properties of in vitro Purkinje cell dendrites in mammalian cerebellar slices. The Journal of Physiology. 305, 197-213 (1980).
- Mintz, M., Lavond, D. G., Zhang, A. A., Yun, Y., Thompson, R. F. Unilateral inferior olive NMDA lesion leads to unilateral deficit in acquisition and retention of eyelid classical conditioning. Behavioral and Neural Biology. 61 (3), 218-224 (1994).
- Welsh, J. P., Harvey, J. A. Cerebellar lesions and the nictitating membrane reflex: performance deficits of the conditioned and unconditioned response. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 9 (1), 299-311 (1989).
- Mauk, M. D., Steinmetz, J. E., Thompson, R. F. Classical conditioning using stimulation of the inferior olive as the unconditioned stimulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (14), 5349-5353 (1986).
- Steinmetz, J. E., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Classical conditioning in rabbits using pontine nucleus stimulation as a conditioned stimulus and inferior olive stimulation as an unconditioned stimulus. Synapse. 3 (3), 225-233 (1989).
- Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: The role of movement oscillations in eyelid conditioning. Frontiers in Integrative Neuroscience. 5, 72 (2011).
- Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-dependent expression of motor learning during eyeblink conditioning in head-fixed mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14845-14853 (2014).
- Heiney, S. A., Kim, J., Augustine, G. J., Medina, J. F. Precise control of movement kinematics by optogenetic inhibition of purkinje cell activity. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2321-2330 (2014).
- Ten Brinke, M. M., et al. Evolving models of pavlovian conditioning: Cerebellar cortical dynamics in awake behaving mice. Cell Reports. 13 (9), 1977-1988 (2015).
- Gao, Z., et al. Excitatory cerebellar nucleocortical circuit provides internal amplification during associative conditioning. Neuron. 89 (3), 645-657 (2016).
- Giovannucci, A., et al. Cerebellar granule cells acquire a widespread predictive feedback signal during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (5), 727-734 (2017).
- Ten Brinke, M. M., et al. Dynamic modulation of activity in cerebellar nuclei neurons during pavlovian eyeblink conditioning in mice. eLife. 6, 28132 (2017).
- Wang, X., Yu, S., Ren, Z., De Zeeuw, C. I., Gao, Z. A FN-MdV pathway and its role in cerebellar multimodular control of sensorimotor behavior. Nature Communications. 11 (1), 6050 (2020).
- Albergaria, C., Silva, N. T., Pritchett, D. L., Carey, M. R. Locomotor activity modulates associative learning in mouse cerebellum. Nature Neuroscience. 21 (5), 725-735 (2018).
- Kim, O. A., Ohmae, S., Medina, J. F. A cerebello-olivary signal for negative prediction error is sufficient to cause extinction of associative motor learning. Nature Neuroscience. 23 (12), 1550-1554 (2020).
- Yamada, T., et al. Sensory experience remodels genome architecture in neural circuit to drive motor learning. Nature. 569 (7758), 708-713 (2019).
- Horlington, M. Startle response circadian rhythm in rats: lack of correlation with motor activity. Physiology & Behavior. 5 (1), 49-53 (1970).
- Yeomans, J. S., Li, L., Scott, B. W., Frankland, P. W. Tactile, acoustic and vestibular systems sum to elicit the startle reflex. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 26 (1), 1-11 (2002).
- . Raspberry Pi Operating system images Available from: https://www.raspberrypi.com/software/operationg-systems/ (2021)
- . VNC Server. VNC® Connect Available from: https://www.realvnc.com/en/connect/download/vnc/ (2021)
- . Anaconda: The world’s most popular data science platform Available from: https://xddebuganaconda.xdlab.co/ (2021)
- De Zeeuw, C. I., Ten Brinke, M. M. Motor learning and the cerebellum. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 021683 (2015).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. Journal of Neurophysiology. 88 (4), 2124-2133 (2002).
- Kloth, A. D., et al. Cerebellar associative sensory learning defects in five mouse autism models. eLife. 4, 06085 (2015).
- Boele, H. -. J., Koekkoek, S. K. E., De Zeeuw, C. I. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 3, (2010).
- Lin, C., Disterhoft, J., Weiss, C. Whisker-signaled eyeblink classical conditioning in head-fixed Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53310 (2016).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
