Этот протокол описывает метод установления модели гематоэнцефалического барьера человека (ГЭБ) in vitro . Эндотелиальные клетки и перициты высеваются с каждой стороны вставного фильтра (кровяного отсека), а астроциты высеваются в нижний колодец (мозговой отсек). Охарактеризованная модель использовалась для экспериментов по переносу наночастиц.
Доставка лекарств в мозг остается проблемой из-за высокоспецифичных и ограничительных свойств гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), которые контролируют и ограничивают доступ к паренхиме мозга. Однако с развитием нанотехнологий были разработаны большие панели новых наноматериалов для улучшения доставки лекарств, подчеркивая необходимость надежных микросистем in vitro для прогнозирования проникновения в мозг в рамках доклинических анализов. Вот простой метод создания микрофизиологической системы для моделирования ГЭБ с использованием исключительно клеток человека. В своей конфигурации модель состоит из тройной культуры, включающей мозгоподобные эндотелиальные клетки (БЛЕК), перициты и астроциты, три основных клеточных субъекта ГЭБ, необходимых для индуцирования и регулирования свойств ГЭБ более физиологическим образом без необходимости подтягивания соединений. Модель, разработанная в формате пластины с 12 лунками, готовая через 6 дней тройной культуры, характеризуется физическими свойствами, экспрессией генов и белков и используется для измерения переноса полимерных наногелей. Модель может быть использована для широкого спектра экспериментов в здоровых и патологических состояниях и представляет собой ценный инструмент для доклинических оценок транспорта молекул и частиц, а также меж- и внутриклеточного трафика.
ГЭБ, локализованный на уровне эндотелиальных клеток капилляров мозга (ЭК), контролирует и регулирует доступ к паренхиме мозга, что имеет решающее значение для поддержания гомеостаза мозга и функции нервных клеток 1,2. Однако в случае патологии головного мозга отсутствие доступа к паренхиме головного мозга представляет собой реальное препятствие для разработки терапевтических стратегий.
BBB EC обладают сложным набором свойств, включая белки плотного соединения (TJ), которые герметизируют межклеточное пространство, связанное с системой эффлюксных насосов, специфических транспортеров и рецепторов, которые контролируют трансклеточный путь 1,2,3. Более того, все эти свойства индуцируются и поддерживаются, благодаря связям с перицитами, встроенными в базальную мембрану BBB EC и астроцитами, чьи конечные ноги окружают капилляры мозга 1,2,3. Следовательно, изучение BBB in vitro является проблемой, учитывая сложность его архитектуры и связи между различными типами клеток, составляющими нейрососудистую единицу (NVU)2. Кроме того, различные типы клеток имеют решающее значение для индукции и поддержания свойств ГЭБ и, следовательно, влияют на прогнозирование пересечения через ГЭБ. Различные стратегии доставки лекарств в мозг уже были протестированы с использованием большой панели тактик для обхода ограниченных свойств ГЭБ4. В последнее время, с развитием нанотехнологий, разрабатываются новые материалы для применения в качестве носителей лекарств 5,6. В дополнение к их более высокой нагрузке, снижению токсичности и повышению биодоступности лекарств, эти новые наноматериалы могут быть функционализированы для стратегии троянского коня, чтобы пересечь ГЭБ и специфически нацеливать клетки в паренхиме 5,6. Среди различных типов оцениваемых наноматериалов наногели привлекли значительное внимание, главным образом из-за их коллоидных свойств и способности адаптировать химическую структуру для введения чувствительных к стимулам свойств 7,8,9,10,11,12,13,14,15.
В настоящее время разрабатываются модели in vitro для доклинических исследований с использованием клеток человека для прогнозирования проникновения в мозг лекарств16. Доступны различные настройки этих моделей, от монослоев ЭК мозга до нескольких клеточных систем16. Учитывая важность клеток NVU в индукции и поддержании BBB и скоординированном ответе на патологическую среду, модели BBB in vitro должны учитывать все эти протагонисты, чтобы повысить актуальность прогноза 2,17.
Текущий метод описывает создание модели тройной культуры in vitro человеческого ГЭБ, которая полностью разработана с клетками человека для изучения специфических клеточных и молекулярных механизмов человека. Чтобы быть физиологически значимой, модель состоит из трех основных клеточных акторов ГЭБ (ЭК, перицитов и астроцитов), необходимых для индуцирования и поддержания свойств ГЭБ, без использования подтягивающих соединений и отображения набора свойств, необходимых для рассмотрения в качестве модели BBB in vitro 16,18. Модель настроена в конфигурации, разграничивающей кровоток и мозговой компартмент, подходящей для доклинических исследований транспорта лекарств и частиц для прогнозирования проникновения в мозг. Полезность модели иллюстрируется измерением переноса полимерных наногелей.
Лечение заболеваний головного мозга остается проблемой, учитывая сложность того, что препараты преодолевают ГЭБ для достижения своих клеточных и молекулярных целей в паренхиме мозга.
Разработка лекарств для лечения заболеваний головного мозга в настоящее время демонстрирует низкий уровень успеха, поскольку большинство препаратов, демонстрирующих многообещающие результаты в доклинических моделях, не показали никакой пользы при использовании в клинике. Следуя «правилу 3R», которое направлено на сокращение числа животных, используемых для экспериментов, разработаны модели BBB in vitro для изучения патологий головного мозга и прогнозирования проникновения в мозг лекарств29. Модели BBB in vitro в основном были разработаны с использованием клеток животных и стали более изощренными для повышения актуальности полученных результатов16. Один из значительных достижений в использовании клеток человека, который приносит неоспоримое новое понимание и большую специфичность, на клеточном и молекулярном уровнях, для изучения механизмов заболеваний человека16. Однако разработка соответствующих моделей требует рассмотрения вопроса об улучшении настроек модели BBB in vitro и знаний, возникающих благодаря моделям животных. Следовательно, необходимо учитывать сложность архитектуры ГЭБ и важность клеточно-клеточных коммуникаций для изучения ГЭБ в физиологических и патологических условиях30.
Протокол, представленный здесь, описывает метод создания полной человеческой модели ГЭБ in vitro , включающей три основных типа клеток ГЭБ, без ограничения доступа к мозговой ткани. Как многоклеточная система, индукция и поддержание свойств ГЭБ, без искусственного использования затягивающих соединений, но вместо этого индуцированных клеточно-клеточными коммуникациями, более физиологически значимы и соответствуют индукции in vivo свойств ГЭБ31. Таким образом, соблюдение хронологии протокола имеет первостепенное значение для успеха протокола. Кроме того, время инкубации во время схватывания тройной культуры и после сборки трех типов клеток представляет собой основные критические этапы протокола.
Свойства ГЭБ в ЕС индуцируются совместной культурой с перицитами, как описано для модели кокультуры24. Следовательно, культивирование перицитов на обратной стороне вставного фильтра является наиболее критической точкой и требует строгого соблюдения протокола с риском отсутствия достаточного количества перицитов для индукции свойств ГЭБ. Прежде всего, во время процедуры нанесения покрытия, а также посева клеток, необходимо уделять внимание тому, чтобы крышка чашки Петри не контактировала с покрытием, а также со средой после посева клеток, чтобы обеспечить хорошее покрытие фильтра и не потерять клетки (этапы 2.2.1 и 2.2.4). Кроме того, после засева перицитов необходимо дождаться указанного времени для прикрепления перицитов (этап 2.2.4), прежде чем возвращать вставной фильтр для покрытия и посева ЕС с другой стороны (этапы 2.2.5 и 2.3). После посева требуется шесть дней, чтобы индуцировать свойства ГЭБ посредством клеточной связи (этап 2.4).
Модель проверяется с точки зрения ограниченной проницаемости (связанной с установкой плотных соединений), поскольку ЭК модели тройной культуры отображают значения проницаемости для маркеров целостности ГЭБ, аналогичных проверенной модели совместной культуры, а также измеренные в проверенных моделях животных или человека 16,27,32. Кроме того, валидация модели BBB in vitro требует, помимо ограниченной проницаемости, чувствительности к другим типам клеток NVU и экспрессии функциональных рецепторов и транспортеров16. Кроме того, модель является воспроизводимой и производит несколько вставных фильтров и скважин для выполнения многочисленных анализов (экспрессия генов и белков, флуоресцентное окрашивание, тесты на токсичность) для каждого типа клеток отдельно, не требуя метода сортировки клеток.
Модель была разработана с использованием фильтра размером пор 0,4 мкм, чтобы иметь один тип ячейки на каждой стороне вставного фильтра. Вставная фильтрующая система позволяла изучать клеточно-клеточные коммуникации в физиологических условиях путем переноса ее на хорошо содержащие астроциты. Наличие астроцитов в системе представляет собой плюсовое значение по сравнению с исходной кокультурой in vitro модели24. Действительно, учитывая важность астроцитов в физиологии ГЭБ, этот третий тип клеток позволяет лучше понять связь между клетками в пределах ГЭБ. Кроме того, система тройной клеточной культуры также может быть изучена при патологических состояниях, таких как инсульт, при котором астроциты играют существенную роль 33,34,35. Кроме того, конструкция БЛЕК/перицитов с обеих сторон вставного фильтра может быть легко размещена на других типах клеток для имитации патологических состояний, таких как рак мозга23.
Размер пор вставного фильтра может привести к ограничениям в некоторых экспериментах, таких как трансмиграция клеток через ГЭБ. Однако разработка модели с большим размером пор требует адаптации протокола для обеспечения образования физиологического монослоя ЕС, а не нескольких слоев, что физиологически не имеет отношения к имитации ГЭБ36.
Применимость модели была продемонстрирована с помощью транспортного эксперимента НГ, демонстрирующего возможность проведения транспортного эксперимента с использованием многоклеточной системы. Тем не менее, следует знать о трудностях, связанных с наличием контрольного соединения или молекулы для транспортного эксперимента, разделяя сопоставимые свойства с НГ, поскольку каждая наноструктура проявляет уникальный набор свойств (молекулярная масса, заряд, форма, физические свойства, образование короны белка).
Одним из ограничений модели является отсутствие напряжения сдвига, которое, как было продемонстрировано, влияет на дифференцировку ЭК и экспрессию белков TJ37. Тем не менее, разработка жидкостной системы, имитирующей капилляр мозга, является сложной задачей, учитывая сложность добавления текучей части, требующей конкретного устройства, в многоклеточную систему. Кроме того, конкретное устройство обычно не является коммерчески доступным и не допускает многих реплик, что делает жидкостные системы менее приспособленными для использования с высокой пропускной способностью.
Таким образом, эта система тройной культуры, состоящая из клеток человека, воспроизводит in vitro архитектуру ГЭБ. Это позволяет генерировать множество вставок, которые могут быть использованы для обширного скрининга соединений.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа предоставляется исследовательской и инновационной программой Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения No 764958 в рамках проекта NANOSTEM, Сети инновационного обучения Марии Склодовской-Кюри (ITN) (стипендия Элеоноры Рицци). Это исследование проводится “Французским обществом по борьбе с раком и детьми в области развития и подростков” (SFCE), Ассоциацией “l’étoile de Martin” и Ассоциацией “Cassandra contre la leucémie”.
Cell Culture | |||
Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
Glutamine | Merck | 1002891000 | |
Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
Immunocytochemistry | |||
SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
Gene expression | |||
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
Protein expression | |||
2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
Tween | Biorad | 1706531 | |
BBB integrity assay | |||
Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
Nanogel Transport | |||
Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |