마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜
Summary
여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.
Abstract
수지상 세포 (DCs)에 대한 수요는 면역학 연구가 진행됨에 따라 점차 증가하고 있습니다. 그러나 DC는 모든 조직에서 드뭅니다. DC를 분리하는 전통적인 방법은 주로 과립구 – 대식세포 콜로니 자극 인자 / 인터루킨 -4 (GM-CSF / IL-4)의 다량 (>10 ng / mL)을 주입하여 골수 (BM) 분화를 유도하여 절차가 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 이 프로토콜에서, 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 배지에서 배양된 모든 BM 세포를 사용하여, 3-4 반배양 교환 후, 마우스(2개의 대퇴골) 당 최대 2.7 x 107개의 CD11c+ 세포(DCs)를 80%-95%의 순도로 수확하였다. 배양 10일 후, CD11c, CD80, 및 MHC II의 발현은 증가한 반면, 세포의 수는 감소하였다. 세포의 수는 배양 7일 후에 최고조에 달했다. 더욱이, 이 방법은 모든 골수 세포를 수확하는 데 10분 밖에 걸리지 않았으며, 배양 1주일 후에 많은 수의 DC가 얻어졌다.
Introduction
Dendritic 세포 (DCs)는 나이브 T 세포를 활성화시키고 감염성 질환, 알레르기 질환 및 종양 세포 1,2,3에 대한 특이적 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 유도하는 가장 강력한 항원 제시 세포 (APCs)입니다. DC는 선천적 면역과 적응 면역 사이의 주요 연결 고리이며 면역 방어 및 면역 관용의 유지에 필수적인 역할을합니다. 지난 40 년 동안 많은 연구자들은 DC의 하위 집합과 염증과 면역에서의 기능을 정의하려고 노력해 왔습니다. 이러한 연구에 따르면, DC는 골수 세포에서 골수성 및 림프계 혈통을 따라 발달합니다. 종양 백신은 최근 몇 년 동안 중요한 이정표를 얻었으며 유망한 미래를 가지고 있습니다. 기계적으로 종양 백신은 면역 반응을 조절하고 종양 항원을 사용하여 세포독성 T 림프구를 활성화시켜 종양 성장을 방지합니다. DC를 기반으로 한 백신은 종양 면역 요법에서 중요한 역할을하며 가장 유망한 항 종양 요법 1,4 중 하나로 확인되었습니다. 또한, DC는 새로운 분자 표적 약물 및 면역 체크포인트 억제제5의 시험에 널리 사용되어 왔다.
연구자들은 DC의 역할을 더 연구하기 위해 많은 수의 고순도 DC가 시급히 필요합니다. 그러나 DC는 다양한 조직과 혈액에서 드물며 인간과 동물의 혈액 세포의 1 % 만 차지합니다. 골수 수지상 세포 (BMDC)의 시험관내 배양은 다량의 DC 세포를 얻기 위한 중요한 방법이다. 한편, 골수에서 DC를 생성하기위한 Lutz 프로토콜은 연구자6에 의해 널리 사용되었습니다. 프로토콜은 DC 세포를 얻는 데 효과적이지만, 고농도의 사이토 카인의 첨가와 적혈구의 용해를 포함하는 복잡하고 비쌉니다.
본 연구에서, 우리는 마우스 골수(BM)로부터 거의 모든 골수 세포를 단리하고 GM-CSF 및 IL-4의 더 낮은 농도로 시험관 내에서 배양한 후 7-9일 후에 BMDC로의 분화를 유도하는 방법을 보고하였다. 이 절차는 거의 모든 골수 세포를 수확하고 완전한 배지에 현탁하는 데 10 분 밖에 걸리지 않습니다. 간단히 말해서, 우리는이 연구에서 BMDC에 대한 효율적이고 비용 효율적인 배양 방법을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간과 마우스는 고전적 DC (cDC1 및 cDC2를 포함한 cDC) 혈장 세포질 세포 ID (pDCs) 및 단핵구 유래 DC (MoDCs) 9,10,11을 포함하여 서로 다른 DC 서브 세트를 갖는다. cDC1s는 세포내 병원체 및 암에 대한 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 조절하고, cDC2는 세포외 병원체, 기생충 및 알레르겐12에 대한 면역 반응을 조절한다는 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 천진 과학 기술 계획 프로그램 (20JCQNJC00550), 천진 보건 과학 기술 프로젝트 (TJWJ202021QN033 및 TJWJ202021QN034)의 지원을 받았다.
Materials
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
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