Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones
Summary
Aquí, presentamos un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea de alta pureza a partir de ratones después de 7 días de cultivo con 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.
Abstract
La demanda de células dendríticas (DC) está aumentando gradualmente a medida que avanza la investigación en inmunología. Sin embargo, los DC son raros en todos los tejidos. El método tradicional para aislar los DC consiste principalmente en inducir la diferenciación de la médula ósea (BM) en DC mediante la inyección de grandes dosis (>10 ng / ml) de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos / interleucina-4 (GM-CSF / IL-4), lo que hace que el procedimiento sea complejo y costoso. En este protocolo, utilizando todas las células BM cultivadas en medio GM-CSF/IL-4 de 10 ng/mL, después de 3-4 intercambios de semicultivo, se cosecharon hasta2,7 x 10 7 células CD11c+ (DC) por ratón (dos fémures) con una pureza del 80%-95%. Después de 10 días en cultivo, la expresión de CD11c, CD80 y MHC II aumentó, mientras que el número de células disminuyó. El número de células alcanzó su punto máximo después de 7 días de cultivo. Además, este método solo tardó 10 minutos en cosechar todas las células de la médula ósea, y se obtuvo un alto número de DC después de 1 semana de cultivo.
Introduction
Las células dendríticas (CD) son las células presentadoras de antígenos (APC) más potentes para activar las células T naïve e inducir respuestas específicas de linfocitos T citotóxicos (CTL) contra enfermedades infecciosas, alergias y células tumorales 1,2,3. Los DC son el vínculo principal entre la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa y desempeñan un papel esencial en la defensa inmunológica y el mantenimiento de la tolerancia inmune. En los últimos 40 años, muchos investigadores han tratado de definir los subconjuntos de DC y sus funciones en la inflamación y la inmunidad. Según esos estudios, los DC se desarrollan a lo largo de los linajes mieloides y linfoides de las células de la médula ósea. Las vacunas contra tumores han ganado hitos significativos en los últimos años y tienen un futuro prometedor. Mecánicamente, las vacunas tumorales modulan la respuesta inmune y previenen el crecimiento tumoral mediante la activación de linfocitos T citotóxicos utilizando antígenos tumorales. La vacuna basada en CD juega un papel importante en la inmunoterapia tumoral y ha sido identificada como una de las terapias antitumorales más prometedoras 1,4. Además, los DC se han utilizado ampliamente en las pruebas de nuevos fármacos dirigidos molecularmente e inhibidores del punto de control inmunitario5.
Los investigadores necesitan urgentemente un alto número de DC de alta pureza para estudiar más a fondo el papel de los DC. Sin embargo, los DC son raros en varios tejidos y sangre, representando solo el 1% de las células sanguíneas en humanos y animales. El cultivo in vitro de células dendríticas de la médula ósea (BMDC) es un método importante para obtener grandes cantidades de células DC. Mientras tanto, el protocolo Lutz para generar DC a partir de la médula ósea ha sido ampliamente utilizado por los investigadores6. Aunque el protocolo es efectivo en la obtención de células DC, es complejo y costoso, ya que implica la adición de altas concentraciones de citoquinas y la lisis de los glóbulos rojos.
En este estudio, informamos un método para aislar casi todas las células de la médula ósea de la médula ósea del ratón (BM) e inducir la diferenciación en BMDC después de 7-9 días de incubación in vitro, con una menor concentración de GM-CSF e IL-4. Este procedimiento solo toma 10 minutos para cosechar casi todas las células de la médula ósea y suspenderlas en un medio completo. En resumen, proporcionamos un método de cultivo eficiente y rentable para BMDC en esta investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los seres humanos y los ratones tienen diferentes subconjuntos de DC, incluidos los DC clásicos (cDC, incluidos los cDC1 y cDC2), los DC plasmocitoides (pDC) y los DC derivados de monocitos (MoDC)9,10,11. En general, se acepta que los cDC1 regulan las respuestas de los linfocitos T citotóxicos (CTL) a los patógenos intracelulares y al cáncer, y los cDC2 regulan las respuestas inmunes a los patógenos, parásitos y alérgenos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa del Plan de Ciencia y Tecnología de Tianjin (20JCQNJC00550), el Proyecto de Ciencia y Tecnología de la Salud de Tianjin (TJWJ202021QN033 y TJWJ202021QN034).
Materials
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
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