Uracil-DNA-Glykosylase-Assay durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie-Analyse

Obwohl Uracil eine normale Base in RNA ist, ist es eine häufige und hochgradig mutagene Läsion in der genomischen DNA. Uracil kann durch spontane/enzymatische hydrolytische Desaminierung eines Desoxycytidins entstehen. In jeder lebenden Zelle tritt diese Desaminierung 100-500 Mal pro Tag unter physiologischen Bedingungen ^auf1,2. Wenn diese Veränderungen nicht repariert werden, kann es zu einer Veränderung der DNA-Sequenzzusammensetzung kommen, die zu einer Mutation führt. Da Uracil in der DNA es vorzieht, sich während der Replikation mit dATP zu paaren, wenn Cytosin zu Uracil deaminiert, wird es in zwei Replikationsereignissen eine neue G: C zu A: T-Übergangsmutation in der Hälfte der Nachkommen ^DNA3 geben.

Unter den zellulären Strategien zur Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität ist die Base Excision Repair (BER) ein wesentlicher Mechanismus, der beschädigte Basen wie Uracil in ^DNA4 repariert. Der BER ist ein hochgradig evolutionär konservierter Prozess. Es gibt zwei allgemeine BER-Signalwege: den Kurzfeldweg, der zu einem Reparaturtrakt eines einzelnen Nukleotids führt, und den Langfeldweg, der einen Reparaturtrakt von mindestens zwei Nukleotiden ^erzeugt5. Der BER ist ein koordinierter Mechanismus, der in mehreren Schritten erfolgt. Der erste Schritt im BER ist die enzymatische Hydrolyse der geschädigten Nukleotidbase durch eine schadensspezifische DNA-Glykosylase zur Erzeugung einer apurinisch/apyrimidinischen (AP) ^{Zwischenstelle6.} Es folgt die Spaltung des Zucker-Phosphat-Rückgrats an der AP-Stelle durch eine Endonuklease, die Reinigung der DNA-Endung durch eine Lyase, die Lückenfüllung durch eine DNA-Polymerase und die Versiegelung des letzten Nicks durch eine ^Ligase5.

Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) hydrolysiert das Uracil aus Uracil-haltiger DNA für BER in Escherichia coli. Herkömmliche UDG-Assays mit radioaktiv markierter DNA mit unterschiedlichen Trenntechniken6,7,8,9,10,11,12,13 sind in der Regel zeitaufwendig, arbeitsintensiv, mit kostspieligen Markierungsreagenzien, komplizierten Verfahren und erfordern intensive Schulungen und ^Übungen, um das Risiko einer Exposition gegenüber radioaktiven Stoffen zu reduzieren. Fluorometrische Oligonukleotid-Assays wurden als Ersatz für die Radioisotopenmarkierung14 entwickelt, zusätzlich zu molekularen Beacons und Förster-Resonanzenergieübertragungstechnologie15,16,17,18,19,20. Für alle oben genannten Methoden ist jedoch eine spezifische Kennzeichnung erforderlich. Kürzlich wurden markierungsfreie Biosensor-Assays21,22,23 und kolorimetrische Methoden entwickelt, die auf der Bildung eines G-Quadruplex24,25,26 basieren. Mehrere A:U-Paare oder speziell entwickelte Sequenzen in den Sonden erschweren jedoch die Definition der Enzymeinheit.

MALDI-TOF MS ist eine Technologie, die bei der DNA-Analyse von großem Nutzen sein könnte. Zu den entwickelten Anwendungen gehören die Einzelnukleotid-Polymorphismus-Genotypisierung27,28, die modifizierte Nukleotidanalyse29 und die DNA-Reparatur-Zwischenidentifikation30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS sollte leicht für die DNA-Glykosylase-Analyse eingesetzt werden, um AP-Site-haltige DNA-Produkte nachzuweisen. AP-Stellen in der DNA sind jedoch unter vielen experimentellen Bedingungen anfällig für ^{Strangbrüche33.} Hier wird ein UDG-Assay vorgestellt, der MALDI-TOF MS verwendet, um die AP-Standortproduktion ohne signifikantes Strangbruchrauschen direkt zu messen. Diese markierungsfreie Methode ist einfach zu bedienen und hat ein hohes Potenzial für die pharmazeutische Anwendung des DNA-Glykosylase-Inhibitor-Screenings.