We beschrijven een dissectietechniek die de architectuur van de neuromusculaire overgang behoudt en een gedetailleerde immunocytochemische studie van motorneuronen in het volwassen Drosophila-been mogelijk maakt.
Drosophila melanogaster vertegenwoordigt een genetisch handelbaar model om neuronale structuur en functie te bestuderen, en daaropvolgende veranderingen in ziektetoestanden. De goed gekarakteriseerde larvale neuromusculaire overgang wordt vaak gebruikt voor dergelijke studies. Snelle larvale ontwikkeling gevolgd door spierhitolyse en remodellering van het zenuwstelsel tijdens metamorfose maakt dit model echter problematisch voor de studie van langzame leeftijdsafhankelijke degeneratieve veranderingen zoals die optreden bij amyotrofische laterale sclerose. Als alternatief leven volwassen vliegen 90 dagen en kan het volwassen been worden gebruikt om motorneuronveranderingen in de loop van de volwassen levensduur te bestuderen met behulp van in vivo fluorescerende beeldvorming door de cuticula. Hier beschrijven we een beendissectietechniek in combinatie met immunocytochemie, die de studie van moleculaire veranderingen op de neuromusculaire kruising van geïdentificeerde volwassen beenmotorneuronen mogelijk maakt. Deze technieken kunnen worden gekoppeld aan een groot aantal antilichamen die zowel pre- als post-synaptische structuren labelen. Samen maken deze procedures een completere karakterisering van langzame leeftijdsafhankelijke veranderingen bij volwassen vliegen mogelijk en kunnen ze worden toegepast op meerdere motorneuronziektemodellen.
Motorneuron (MN) ziekten omvatten een groep heterogene aandoeningen die progressieve degeneratie omvatten die leidt tot spierafbraak en verlamming als een primair klinisch fenotype1. Hoewel zeldzaam met een wereldwijde prevalentie van 4,5 per 100.000, wordt verwacht dat deze prevalentie zal toenemen met een vergrijzende bevolking2. Amyotrofische laterale sclerose (ALS) is de meest voorkomende MN-ziekte (MND) en is meestal fataal binnen een korte tijd na diagnose zonder dat er bestaande ziektemodificerende behandelingen beschikbaar zijn3. MND’s delen een langdurige presymptomatische fase met vroege moleculaire biomarkerveranderingen en functionele beeldvormingsveranderingen bij patiënten4. Vroege presymptomatische cellulaire pathologie wordt ook waargenomen in niet-menselijke ziektemodellen5,6,7,8. De studie van vroege veranderingen op de neuromusculaire kruising is belangrijk voor het begrijpen van de pathogenese van MN-ziekte en kan helpen bij het ontwikkelen van vroege diagnostiek en potentiële therapieën.
Een schat aan genetische en moleculaire hulpmiddelen bestaat in Drosophila om de structuur en functie van de neuromusculaire junctie te ontleden (NMJ, zie9 voor een overzicht van de goed gekarakteriseerde larvale NMJ). Deze hulpmiddelen in combinatie met een korte levensduur maken Drosophila een uitstekend model om neurodegeneratieve veranderingen bij de NMJ te bestuderen. In het bijzonder zijn MNs die volwassen spieren innerveren aanwezig gedurende de ~ 90-daagse volwassen levensduur en zijn ze onderhevig aan normale verouderingsprocessen10,11,12,13. De volwassen MN’s bieden daarom de mogelijkheid om langzame degeneratieve veranderingen te bestuderen in tegenstelling tot larvale NMJ’s die slechts gedurende een korte periode van ~ 1 week voorafgaand aan de metamorfose bestaan14,15.
Hier beschrijven we een dissectieprocedure waarmee we immunocytochemische analyse van MN’s in het volwassen been kunnen uitvoeren. Elk volwassen been wordt geïnnerveerd door ~ 50 MNs, die synapsen op de bijbehorende beenspier om de voortbeweging te stimuleren. De beenanatomie, mechanische fysiologie en neurobiologie is goed beschreven16,17,18. Axon-prieeltjes van been-MNs zijn eerder gekenmerkt door beeldvorming door cuticula in met rug gevulde of genetisch gelabelde celpopulaties met behulp van het bipartiete Gal4 / UAS-systeem en beeldvormingsmethoden zijn eerder gepubliceerd19. De hier gepresenteerde dissectiemethoden behouden de axonvertakkingsmorfologie en stellen ons in staat om een breed scala aan antilichamen te gebruiken om verschillende moleculaire componenten van de NMJ te labelen. Ons eerdere werk heeft zich gericht op projecties van een gedefinieerd MN in het metathoracale (3e) been, dat de tibia levatorspier (tilm) innerveert en consistente arborisatiepatronen en boutongetallen vertoont. Aanvankelijk bestudeerden we leeftijdsafhankelijke veranderingen in Drosophila superoxide dismutase 1 (dsod1) mutanten en vonden veranderingen die consistent waren met de ontmanteling van de NMJ20. Deze dissectiemethoden bieden de mogelijkheid om langzame degeneratieve veranderingen bij de NMJ beter te karakteriseren voor andere ALS-modellen, basisstudies van veroudering en andere MN-geassocieerde ziekten.
Figuur 1. Werkstroomoverzicht voor het ontleden van benen. Zie protocol voor gedetailleerde stappen. (A,B) Vliegen worden geselecteerd en verdoofd. (C) Vliegen worden overgebracht op methanol en gewassen met PBS. (D) De metathoracale benen worden verwijderd aan de basis van de coxa terwijl ze worden gevisualiseerd met een ontleedmicroscoop (~ 30x vergroting); schaalbalk = 500 μm. (E) De poten worden vervolgens gedurende 30 minuten in 3,7% formaldehyde/PBS (FA) oplossing gefixeerd in putten van 24-putplaten en vervolgens wordt FA verwijderd door wasbeurten met PBS. (F, G, H) Benen worden overgebracht naar siliconen elastomeer ontleedbakken en een stuk cuticula wordt verwijderd van het proximale dijbeen met behulp van afgeschuinde tang terwijl gevisualiseerd onder een ontleedmicroscoop op 80x; schaalbalk = 50 μm. (I) Poten worden na dissectie gefixeerd in FA en gewassen in PBS en vervolgens PBT (PBS+ 0,1% niet-ionische oppervlakteactieve stof). (J) Benen worden onderworpen aan immunocytochemische kleuring. (K,L) Poten worden overgebracht naar een glazen dia, gewist in montagemedia en bedekt met een dekplaat met kleiafstandhouders; schaalstaven = 2 mm en 500 μm. (M) Benen worden in beeld gebracht door confocale microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het Drosophila volwassen been is een ideaal model om neurodegeneratie te bestuderen gezien de relatieve eenvoud met goed gekarakteriseerde MN’s in kaart gebracht uit neuroblastlijnen en stereotiepe arborisatiepatronen. Verschillende rapporten hebben eerder been-MN’s gebruikt voor de studie van neurodegeneratieve ziekten21,22. Deze studies maakten gebruik van GFP-expresserende lijnen in combinatie met mozaïekanalyse met een repressible cell marker (MARCM) om door de cuticula te beeldlen en documenteerden een reeks morfologische veranderingen. Beeldvorming van volwassen NMJ’s door immunocytochemie met gereseceerde cuticula maakt verdere karakterisering mogelijk met de mogelijkheid om complexe moleculaire veranderingen te volgen met behulp van een toolbox van beschikbare antilichamen.
Het immunocytochemische gedeelte van dit protocol is relatief standaard en kan onafhankelijk van het genotype worden geïmplementeerd (zie23 voor een uitstekende beschrijving van algemene antilichaamkleuringsmethoden voor gebruik met Drosophila). Bovendien kunnen parameters zoals fluorescentie-intensiteit, axontaklengte en boutonaantallen en -grootte worden bepaald met behulp van een verscheidenheid aan beschikbare ImageJ-macro’s zodra afbeeldingen zijn vastgelegd en gedetailleerde methoden voor kwantitatieve analyse zijn gepubliceerd (zie bijvoorbeeld 24,25,26). De dissectietechniek is dus de belangrijkste innovatie die hier wordt beschreven. Voorafgaand aan dissectie worden vliegen ondergedompeld in een alcohol om cuticulaire koolwaterstoffen te strippen. Zowel ethanol als methanol worden vaak voor dit doel gebruikt; we hebben echter alleen methanol gebruikt. Cruciaal voor het succes van de dissectie zijn verschillende factoren: ten eerste zorgt het gebruik van een aangepaste tang met een schuine kant voor zeer oppervlakkig contact met de cuticula. Ten tweede, met behulp van een ontleedmicroscoop die in staat is tot 60-100x totale vergroting, zodat het oppervlak van de cuticula duidelijk zichtbaar is. Voor microscopen met een lagere maximale vergroting zijn 2x objectieven beschikbaar voor de meest voorkomende merken en zouden voldoende moeten zijn in combinatie met bestaande lenzen. Ten derde maakt de eerste fixatiestap de nagelriem broos en gemakkelijker weg te trekken zonder de spieren eronder te beschadigen. Overfixatie bij deze stap maakt het hele been te stijf voor een effectieve dissectie. Daarom moet de initiële fixatie worden beperkt tot 30 minuten. Het formaldehydefixatiemiddel zal gedurende deze korte periode niet voldoende doordringen om het onderliggende weefsel effectief te kruisen en daarom is een tweede fixatiestap noodzakelijk. Voorafgaand aan de tweede fixatie moeten weefsels op ijs worden gehouden om afbraak en veranderingen in morfologie te voorkomen. Ten vierde hebben we ontdekt dat het ontleden van monsters terwijl kou ook belangrijk is, waarschijnlijk om vergelijkbare redenen omdat de nagelriem broos is en een klein stukje gemakkelijker kan worden verwijderd.
Met oefening vinden we dat ~ 50% van de dissecties bruikbaar zal zijn binnen geen waarneembare weefselschade. Hoewel dit percentage laag lijkt in vergelijking met sommige andere weefsels, is de dissectieprocedure snel en kunnen veel benen in 30- 60 minuten worden verwerkt. Daarom, zelfs als de slagingspercentages in eerste instantie laag zijn, is het haalbaar om 4-5 goede monsters te verkrijgen voor elke experimentele groep. Een beperking kan echter het aantal vliegen zijn dat op een bepaald moment beschikbaar is als genotypen en /of leeftijd resulteren in aanzienlijke letaliteit.
Een andere beperking is dat we andere delen van het been buiten het proximale gebied van het dijbeen niet hebben kunnen ontleden vanwege de grootte. Zo kunnen we geïdentificeerde MN-prieeltjes bestuderen die de TILM betrouwbaar innerveren en is het mogelijk om de cuticula boven de tibia-depressorspier te ontleden met kleine veranderingen in de manier waarop het been is georiënteerd bij het ontleden. De toegang tot andere delen van het been is echter moeilijker gebleken zonder de axonale architectuur tijdens de dissectie te verstoren.
Hier presenteren we dissectiemethoden om veranderingen bij de volwassen NMJ te detecteren voor gedefinieerde MN’s die de tilm innerveren met behulp van immunocytochemie. Het been is nuttig als een eenvoudig systeem, geïnnerveerd door slechts ~ 50 MNs en bevat 14 spieren met een goed beschreven anatomie. Het ontleedde beenpreparaat kan worden gebruikt voor alle genotypen en een reeks antilichamen is beschikbaar voor NMJ-visualisatie zonder de noodzaak om genotypisch complexe voorraden reportergenconstructen in mutante achtergronden te bouwen. Deze aanpak zal een meer gedetailleerde karakterisering van veranderingen bij de NMJ voor MN-ziekten en andere leeftijdsgerelateerde aandoeningen mogelijk maken.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Eric Roberts voor haar advies over beeldvorming. We willen ook Information Technology Services aan het Rhode Island College bedanken en in het bijzonder Michael Caine en Jake Douglas voor videografie. Monoklonale antilichamen anti-dlg en anti-brp werden ontwikkeld door respectievelijk UC-Berkeley en Universitaetsklinikim Wuerzburg, en werden verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank, gecreëerd door de NICHD van de NIH en onderhouden aan de Universiteit van Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242, VS. Het hier gerapporteerde onderzoek werd volledig ondersteund door het Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder subsidienummer [P20GM103430].
10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
24 well plates | Corning | 3473 | Hydrophobic, ultra-low attachment surface |
2x objective accessory | Olympus | 110AL2X | Screw-on attachment |
Anti-ATP5A primary antibody | Abcam | ab14748 | Mouse monoclonal |
Anti-bruchpilot primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Mouse monoclonal |
Anti-discs large primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Mouse monoclonal |
Anti-hrp primary antibody | Jackson Immuno Research | 123-605-021 | Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal |
Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody | Millipore Sigma | 04-263 | Mouse monoclonal |
Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Objectives (NA): 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40) |
Coverslips | Corning | 285022 | 160-190 mm thickness |
Dissecting forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Dumont #5SF |
Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | 37% stock stabilized with methanol |
Goat anti-mouse secondary antibody | Jackson Immuno Research | 115-545-146 | Alexa Fluor 488 conjugated |
Goat Serum | Novus Biologicals | NB036768 | 0.2 mm filtered |
Laboratory sealing tape | Fisher Scientific | 03-448-254 | Parafilm M |
Methanol | Fisher Scientific | A413 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | 76mm x 25mm |
Mounting media | Molecular Probes | S36972 | Slowfade Diamond mounting media |
Nonionic surfactant | Acros Organics | 215680010 | Triton-X 100 |
Nutator | Fisher Scientific | S06622 | |
Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Alexa Fluor 555- conjugated |
Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | |
Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 2423610 | Sylgard 184 |