Summary

הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM

Published: July 26, 2021
doi:

Summary

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט להכנת רשתות דגימה בטמפרטורות של עד 70 מעלות צלזיוס, לפני שקיפאון הצניחה לניסויי cryo-EM.

Abstract

רשתות הדגימות לניסויים במיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים (cryo-EM) מוכנות בדרך כלל בטמפרטורה אופטימלית לאחסון דגימות ביולוגיות, לרוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולעיתים בטמפרטורת החדר. לאחרונה גילינו שמבנה החלבון שנפתר בטמפרטורה נמוכה עשוי שלא להיות רלוונטי מבחינה תפקודית, במיוחד עבור חלבונים מארכאה תרמופילית. פותח הליך להכנת דגימות חלבון בטמפרטורות גבוהות יותר (עד 70 מעלות צלזיוס) לניתוח cryo-EM. הראינו שהמבנים מדגימות שהוכנו בטמפרטורות גבוהות יותר רלוונטיים מבחינה פונקציונלית ותלויים בטמפרטורה. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת רשתות מדגם בטמפרטורה גבוהה, תוך שימוש ב- 55 מעלות צלזיוס כדוגמה. הניסוי עשה שימוש במנגנון ויטריפיקציה ששונה באמצעות צינור צנטריפוגה נוסף, ודגימות דוגרו בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. הנהלים המפורטים היו מכווננים כדי למזער את עיבוי האדים ולקבל שכבה דקה של קרח על הרשת. דוגמאות לניסויים מוצלחים ולא מוצלחים מסופקים.

Introduction

טכנולוגיית cryo-EM לפתרון מבנים של קומפלקסים חלבונים המשיכה להשתפר, במיוחד בכיוון של קבלת מבנים ברזולוציה גבוהה 1,2. בינתיים, הנוף של היישום שלה הורחב גם על ידי שינוי תנאי הדגימה כגון pH או ליגנדות לפני תהליך vitrification3, הכולל הכנת רשתות דגימה ואחריו הקפאת צלילה 4,5. תנאי חשוב נוסף הוא הטמפרטורה. למרות שניסויי cryo-EM, כמו קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, מבוצעים בטמפרטורות נמוכות, המבנה שנפתר על ידי cryo-EM משקף את המבנה במצב התמיסה לפני הוויטריפיקציה. עד לאחרונה, רוב מחקרי הקריו-EM של ניתוח חלקיקים בודדים (SPA) משתמשים בדגימות שנשמרות על קרח (כלומר, ב-4 מעלות צלזיוס) לפני ויטריפיקציה6, אם כי מספר מחקרים משתמשים בדגימות בטמפרטורת החדרסביב 7,8,9,10 או עד 42 מעלות צלזיוס 11. בדו”ח שפורסם לאחרונה, ביצענו מחקרים תלויי טמפרטורה של האנזים קטול-חומצה רדוקטויזומראז (KARI) מהארכיאון התרמופילי סולפולובוס סולפטריקוס (Sso) בשש טמפרטורות שונות מ-4 מעלות צלזיוס עד 70 מעלות צלזיוס12. המחקרים שלנו מצביעים על כך שחשוב להכין רשתות דגימה בטמפרטורות רלוונטיות מבחינה פונקציונלית וכי cryo-EM היא השיטה המבנית היחידה האפשרית למעשה לפתרון המבנה של אותו קומפלקס חלבונים בטמפרטורות מרובות.

הקושי העיקרי לוויטריפיקציה בטמפרטורות גבוהות הוא למזער את עיבוי האדים ולהשיג קרח דק. כאן אנו מדווחים על הפרוטוקול המפורט המשמש להכנת רשתות מדגם בטמפרטורות גבוהות במחקר הקודם שלנו על Sso-KARI 12. אנו מניחים שהקוראים או הצופים כבר מנוסים בהליכי הכנת המדגם הכוללים ועיבוד הנתונים לניסויים cryo-EM ומדגישים את ההיבטים הרלוונטיים לטמפרטורה גבוהה.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה נועד להשתמש במנגנון ויטריפיקציה מסחרי שונה כדי להכין את דגימות מיקרוסקופיית הקריו-אלקטרונים (cryo-EM) בטמפרטורות ספציפיות, גבוהות במיוחד מ-37 מעלות צלזיוס. מערך הניסוי הכולל מוצג באיור 1. הפרוטוקול משתמש ב-55 מעלות צלזיוס כדוגמה. לגבי התנאים הספציפיים בטמפרטו?…

Representative Results

סקירת ההגדלה הנמוכה מוצגת באיור 5A,B. לוח A הוא דוגמה לרשת מוצלחת. יש שיפוע קרח משמאל למעלה (עבה יותר) לימין למטה (דק יותר או ריק). רשת כזו מקלה על מציאת עובי מתאים של שכבת הקרח באזור האמצעי המתאים לאיסוף נתונים, כגון הקופסאות הכחולות והירוקות. הרשת B יבשה מדי. לריבועים ב…

Discussion

בשלב 1 של הפרוטוקול, ודא שצינור הצנטריפוגה הותקן היטב ואינו נופל כאשר הניסוי בעיצומו. בשל הצטברות של מספר רב של טיפות מים בתא, אשר יכול לשנות את יכולת ספיחה של נייר הסינון, מומלץ כי הזמן הכולל של הניסוי לא יעלה על 30 דקות לאחר שתא מנגנון הוויטריפיקציה הגיע לטמפרטורת שיווי המשקל. אם זמן הפעולה …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לד”ר הרבה רמיגי מתרמו פישר סיינטיפיק על עצות מועילות. ניסויי הקריו-EM בוצעו במתקן האקדמיה סיניקה קריו-EM (ASCEM). ASCEM נתמך על ידי האקדמיה הסינית (מענק לא. AS-CFII-108-110) ופרויקט החלבון של טייוואן (מענק מס’ AS-KPQ-109-TPP2). המחברים מודים גם לגב’ הוי-ג’ו הואנג על הסיוע בהכנת הדגימה.

Materials

Falcon tube Falcon 352070 size: 50 mL
Filter paper Ted Pella 47000-100 Ø55/20mm, Grade 595
HI1210 Leica water bath
K100X Electron Microscopy Sciences glow discharge
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid Ted Pella 658-200-CU-100
Titan Krios G3 Thermo Fisher Scientific 1063996 low dose imaging
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific 1086439
Vitrobot Tweezer Ted Pella 47000-500

References

  1. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
  2. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
  3. Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
  4. Cabra, V., Samsó, M. Do’s and don’ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
  5. Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
  6. Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
  7. Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
  8. Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
  9. Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
  10. Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
  11. Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
  12. Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).

Play Video

Cite This Article
Chang, Y., Chen, C., Tsai, M. Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM. J. Vis. Exp. (173), e62772, doi:10.3791/62772 (2021).

View Video