Summary

Исследования взаимодействия шаперон-кочаперон с использованием гомогенного бисероплетения

Published: July 21, 2021
doi:

Summary

Этот протокол представляет собой метод исследования белково-белковых взаимодействий с использованием глутатион-связанных донорских шариков с GST-сплавленными TPR-мотив-ко-шаперонами и акцепторными шариками в сочетании с пептидом, полученным из Hsp90. Мы использовали этот метод для скрининга небольших молекул для нарушения взаимодействий Hsp90-FKBP51 или Hsp90-FKBP52 и идентифицировали мощные и селективные ингибиторы взаимодействия Hsp90-FKBP51.

Abstract

Нацеливание на взаимодействие белка теплового шока 90 (Hsp90)-кочаперона дает возможность специфически регулировать Hsp90-зависимые внутриклеточные процессы. Законсервированный пентапептид MEEVD на С-конце Hsp90 отвечает за взаимодействие с мотивом тетратрикопептидного повтора (TPR) ко-шаперонов. FK506-связывающий белок (FKBP) 51 и FKBP52 являются двумя аналогичными TPR-мотивными ко-шаперонами, участвующими в стероидных гормонозависимых заболеваниях с различными функциями. Таким образом, идентификация молекул, специфически блокирующих взаимодействия между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52, обеспечивает многообещающий терапевтический потенциал для нескольких заболеваний человека. Здесь мы описываем протокол для усиленного люминесцентного равноконтактного однородного анализа для зондирования взаимодействий между Hsp90 и его партнерскими ко-шаперонами FKBP51 и FKBP52. Во-первых, мы очистили TPR-мотив-содержащие белки FKBP51 и FKBP52 в форме, помеченной глутатион S-трансферазой (GST). Используя глутатион-связанные донорские шарики с GST-сплавленными белками TPR-мотива и акцепторными шариками в сочетании с 10-мерным С-концевым пептидом Hsp90, мы исследовали белково-белковые взаимодействия в однородной среде. Мы использовали этот анализ для скрининга небольших молекул для нарушения взаимодействий Hsp90-FKBP51 или Hsp90-FKBP52 и идентифицировали мощные и селективные ингибиторы взаимодействия Hsp90-FKBP51.

Introduction

Молекулярные шапероны способствуют гомеостазу белка, включая сворачивание белка, транспорт и деградацию. Они регулируют несколько клеточных процессов и связаны с многочисленными заболеваниями, такими как рак и нейродегенеративные заболевания1. Белок теплового шока 90 (Hsp90) является одним из наиболее важных шаперонов, функция которого зависит от конформационных изменений, вызванных гидролизом АТФ и связыванием с клиентскими белками, опосредованными его ко-шаперонами2. Несмотря на очевидный потенциал Hsp90 в качестве терапевтической мишени, тонкая настройка его функции представляет собой большую проблему. Существует несколько ингибиторов Hsp90, нацеленных на N-концевую область связывания АТФ, которые были оценены в клинических испытаниях, но ни один из них не был одобрен для маркетинга3. Из-за отсутствия четко определенного лигандсвязывающегокармана 4,нацеливание на С-концевую область Hsp90 имело ограниченный успех4. В последнее время нарушение взаимодействий Hsp90-кохаперонов малыми молекулами было исследовано в качестве альтернативной стратегии5. Нацеливание на взаимодействия Hsp90-кохаперонов не вызывает общей реакции клеточного стресса и дает возможность специфически регулировать различные внутриклеточные процессы. Законсервированный пентапептид MEEVD на С-конце Hsp90 отвечает за взаимодействие с мотивом тетратрикопептидного повтора (TPR) ко-шаперонов6. Из 736 белков, содержащих мотивы TPR, аннотированных в базе данных белков человека, ~ 20 различных белков взаимодействуют с Hsp90 через этотпептид 7. Молекулы, конкурирующие за пептидное связывание MEEVD, нарушат взаимодействие между Hsp90 и ко-шаперонами, содержащими домен TPR. Сайт связывания пептидов имеет сходную третичную структуру, но общая гомология между различными доменами мотивов TPR относительно низкая7,что дает возможность идентифицировать молекулы, специально способные блокировать взаимодействия между Hsp90 и конкретными TPR-мотивными ко-шаперонами. Среди этих TPR-мотивных ко-шаперонов FK506-связывающий белок (FKBP) 51 и FKBP52 являются регуляторами передачи сигналов рецепторов стероидных гормонов (SHR) и участвуют в нескольких стероидных гормонозависимых заболеваниях, включая рак, связанные со стрессом заболевания, метаболические заболевания и болезнь Альцгеймера8. Хотя FKBP51 и FKBP52 имеют > 80% сходства последовательностей, их функции различаются: FKBP52 является положительным регулятором деятельности SHR, в то время как FKBP51 является отрицательным регулятором в большинстве случаев8. Таким образом, идентификация молекул, специфически блокирующих взаимодействия между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52, обеспечивает многообещающий терапевтический потенциал для связанных заболеваний.

Усыпляемый L-умингесцентный Proximity Homogenous Assay (AlphaScreen) был впервые разработан в 1994 году Ullman EF et al.9. В настоящее время он широко используется для обнаружения различных типов биологических взаимодействий, таких какпептид 10,белок11,ДНК12,РНК13и сахар14. В этой технике существует два вида бусин (диаметр 200 нм), один из них является донорской бусиной, а другой – акцепторной бусиной. Биомолекулы иммобилизуются на эти шарики; их биологические взаимодействия приводят к сближению бусин донора и акцептора. При 680 нм фотосенсибилизатор в донорской бусине освещает и преобразует кислород в синглетный кислород. Поскольку синглетный кислород имеет короткое время жизни, он может диффундировать только до 200 нм. Если шарик акцептора находится в непосредственной близости, его производное тиоксена реагирует с синглетным кислородом, генерируя хемилюминесценцию при 370 нм. Эта энергия дополнительно активирует флуорофоры в том же акцепторном шарике, чтобы излучать свет при 520-620 нм15. Если биологические взаимодействия нарушаются, акцепторная бусина и донорская бусина не могут достичь близости, что приводит к распаду синглетного кислорода и низкому образуемого сигнала.

Здесь мы описываем протокол, использующий этот метод для скрининга малых молекул, ингибируя взаимодействия между Hsp90 и TPR ко-шаперонами, особенно FKBP51 и FKBP52. 10 аминокислот длинных пептидов, соответствующих экстремальному С-конце Hsp90, прикреплены к акцепторным шарикам. Очищенные GST-помеченные ко-шапероны TPR взаимодействуют с донорскими шариками, связанными с глутатионом. Когда взаимодействие между пептидами, полученными из Hsp90, и ко-шаперонами TPR-мотива сближает шарики, образуется усиленный сигнал(рисунок 1A). Если экранированные малые молекулы могут ингибировать взаимодействия между Hsp90 и TPR-мотивными ко-шаперонами, этот усиленный сигнал будет уменьшен(рисунок 1B). Их IC50 может быть рассчитан путем количественного измерения. Этот протокол может быть распространен на любые интересующих взаимодействия шаперона – TPR-мотива и имеет большое значение в разработке новых молекул, в частности блокирующих взаимодействие между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52.

Figure 1
Рисунок 1:Основной принцип этого анализа. (A) Очищенный GST-FKBP51 взаимодействует с глутатион-связанными донорскими шариками. 10 аминокислот длинных пептидов, соответствующих экстремальному С-конце Hsp90, прикреплены к акцепторным шарикам. Взаимодействие между пептидами, полученными из Hsp90, и доменом TPR FKBP51 приближает донорские и акцепторные шарики. При 680 нм фотосенсибилизатор в донорской бусине освещает и преобразует кислород в синглетный кислород. Производное тиоксена на акцепторной бусине реагирует с синглетным кислородом и генерирует хемилюминесценцию при 370 нм. Эта энергия дополнительно активирует флуорофоры в том же акцепторном шарике, чтобы излучать свет при 520-620 нм. (B) Когда малые молекулы ингибируют взаимодействия между Hsp90 и FKBP51, донорские и акцепторные шарики не могут достичь близости. Затем синглетный кислород с коротким сроком службы распадается, и не вырабатывается обнаруживаемый сигнал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор этого протокола показан на рисунке 2. 1. Экспрессия и очистка GST-FKBP51 и GST-FKBP52(рисунок 2A) ПлазмидыПРИМЕЧАНИЕ: Получите клоны кДНК для человека FKBP51 (идентификатор клона: 5723416) и для человека FKBP52 (идентификатор к…

Representative Results

В нашем анализе Z’-фактор и отношение S/B составляют 0,82 и 13,35 соответственно(рисунок 3A),демонстрируя, что наш анализ является надежным и надежным для высокопроизводительного скрининга. Затем мы использовали его для скрининга соединений с малой молекулярной массой. <strong class…

Discussion

Здесь мы описываем протокол, использующий анализ для скрининга малых молекул, ингибируя взаимодействия между Hsp90 и TPR-мотивными ко-шаперонами, особенно FKBP51 и FKBP52. Его высокий балл Z’ (>0,8) демонстрирует надежность и надежность для формата с высокой пропускной способностью. Результаты могу…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано грантами Шведского исследовательского совета (2018-02843), Фонда мозга (Fo 2019-0140), Фонда гериатрических заболеваний в Каролинском институте, Фонда Гунвора и Йозефа Анерса, Фонда Магнуса Бергваллса, Фонда Гана и Бертиля Стонеса, Фонда медицинских исследований Торе Нильссона, Фонда Маргареты аф Угглас и Фонда старых слуг.

Materials

384-well plates Perkin Elmer 6008350 Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit Millipore UFC901008 Concentrate protein
Ampicillin Sigma A0166 Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010 Heidolph Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51 Source BioScience clone id: 5723416 pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52 Source BioScience clone id: 7474554 pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli Invitrogen C602003 One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software GraphPad Prism 9.0.0 Analysis data and make figures
Data analysis software Excel Analysis data
DMSO Supelco 1.02952.1000 Dilute compounds
DPBS Gibco 14190-144 Prepare solution
EDTA Calbiochem 344504 Prevent proteolysis during sonication
Glutathione Sigma G-4251 Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads Perkin Elmer 6765300 Donor bead
GST-trap column Cytiva (GE Healthcare) 17528201 Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside Thermo Fisher Scientific R0392 Induce protein expression
LB Broth (Miller) Sigma L3522 Microbial growth medium
PCR instrument BIO-RAD S1000 Thermal Cycler Amplification/PCR
PD-10 column Cytiva (GE Healthcare) 17085101 Solution exchange
pGEX-6P-1 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954648 Plasmid
pGEX-6P-2 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954650 Plasmid
Plate reader Perkin Elmer EnSpire 2300 Multilabel Reader Read alpha plate
Plate reader software Perkin Elmer EnSpire Manager Plate reader software
Plate reader software protocol Perkin Elmer Alpha 384-well Low volume Use this protocol to read plate
PMSF Sigma P7626 Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail Sigma S8830 Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide Sigma S2002 As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma 156159 Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform Peptide 2.0 inc Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator LABINCO Make end-over-end agitation
Tris-HCl Sigma 10708976001 Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20 Sigma P1379 Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP Beckman Coulter Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor Microson Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads Perkin Elmer 6762003 Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Invitrogen EI0002 SDS-PAGE

References

  1. Muchowski, P. J., Wacker, J. L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).
  2. Eckl, J. M., Richter, K. Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).
  3. Yuno, A. Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).
  4. Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer. European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).
  5. Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer’s disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).
  6. Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).
  7. Scheufler, C., et al. Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell. 101 (2), 199-210 (2000).
  8. Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease. Trends in Endocrinology & Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).
  9. Ullman, E. F., et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).
  10. Wigle, T. J., et al. Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins. Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).
  11. Guenat, S., et al. Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates. Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).
  12. Sabatucci, A., et al. A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV. Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).
  13. Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).
  14. Huang, X., et al. A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan. Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).
  15. Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences Available from: https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf (2021)
  16. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).

Play Video

Cite This Article
Wang, L., Bergkvist, L., Kumar, R., Winblad, B., Pavlov, P. F. Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay. J. Vis. Exp. (173), e62762, doi:10.3791/62762 (2021).

View Video