Questo protocollo presenta passaggi per acquisire e analizzare immagini fluorescenti di calcio da periciti che riscaldano il cervello e dati sul flusso sanguigno dai vasi sanguigni vicini in topi anestetizzati. Queste tecniche sono utili per gli studi di fisiologia delle cellule murali e possono essere adattate per studiare i transitori di calcio in qualsiasi tipo di cellula.
I recenti progressi nella biologia delle proteine e nella genetica dei topi hanno permesso di misurare le fluttuazioni intracellulari del calcio delle cellule cerebrali in vivo e di correlarle con l’emodinamica locale. Questo protocollo utilizza topi transgenici che sono stati preparati con una finestra cranica cronica ed esprimono l’indicatore di calcio geneticamente codificato, RCaMP1.07, sotto il promotore dell’actina muscolare α-liscia per etichettare specificamente le cellule murali, come le cellule muscolari lisce vascolari e i periciti che riscaldano. I passaggi sono delineati su come preparare un catetere della vena della coda per l’iniezione endovenosa di coloranti fluorescenti per tracciare il flusso sanguigno, nonché su come misurare il calcio dei periciti cerebrali e l’emodinamica dei vasi sanguigni locali (diametro, velocità dei globuli rossi, ecc.) mediante due microscopi a fotoni in vivo attraverso la finestra cranica in topi anestetizzati con ketamina / xilazina. Infine, vengono forniti dettagli per l’analisi delle fluttuazioni del calcio e dei filmati del flusso sanguigno tramite gli algoritmi di elaborazione delle immagini sviluppati da Barrett et al. 2018, con particolare attenzione a come questi processi possono essere adattati ad altri dati di imaging cellulare.
La vascolarizzazione del sistema nervoso centrale è costituita da arteriole penetranti, capillari e venule ascendenti. All’interno di questa rete, le cellule murali come le cellule muscolari lisce vascolari encase arteriole e periciti estendono i processi cellulari lungo i primi rami e capillari arterioli1. I periciti sembrano avere diversi ruoli all’interno del cervello tra cui il mantenimento della barriera emato-encefalica1,2,la migrazione e la motilità3,le potenziali proprietà delle cellule staminali e la regolazione del flusso sanguigno cerebrale4,5,6. Molti dei ruoli funzionali dei periciti sono stati collegati a fluttuazioni del calcio intracellulare che possono regolare la dilatazione o la contrazione di queste cellule4,5,6.
Diversi studi recenti hanno stabilito criteri per identificare diversi tipi di periciti cerebrali7,8. Le cellule murali all’interno dei primi 4 rami delle arteriole penetranti sono periciti avvolgenti in base alla loro espressione della proteina contrattile α-liscia dell’actina muscolare (αSMA) e del loro somata ovoidale sporgente con processi che avvolgono i vasi7,8,9. Per visualizzare le fluttuazioni del calcio nei periciti ensheathing, questo protocollo utilizza una nuova linea di topo transgenico, Acta2-RCaMP1.07, nota anche come Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. Questi topi esprimono l’indicatore rosso del calcio geneticamente codificato, RCaMP1.07, nelle cellule che esprimono αSMA (cellule muscolari lisce vascolari e periciti che si riscaldano). Le colonie riproduttive vengono mantenute incrociando animali non aerei con emizigoti. RCaMP1.07 è una proteina fluorescente rossa con un dominio di legame calmodulina, che aumenta la fluorescenza quando si lega al calcio intracellulare10,11. Questo protocollo delinea i passaggi per l’imaging combinato del calcio dei periciti insanguinati e le misurazioni del flusso sanguigno mediante microscopia a due fotoni, comprese le procedure per l’iniezione della vena caudale di coloranti fluorescenti, l’acquisizione di immagini al microscopio in topi anestetizzati e l’analisi dei dati con piattaforme di programmazione (Figura 1). Queste tecniche sono utili per affrontare domande sulla fisiologia delle cellule murali, ma possono essere adattate per studiare i transitori di calcio in qualsiasi tipo di cellula nel cervello o in altri sistemi di organi.
Un topo Acta2-RCaMP1.07 femmina di 10 mesi è stato utilizzato per l’esperimento presentato in questo articolo. Il topo è stato sottoposto a un intervento chirurgico per la finestra cranica cronica e l’impianto post testa due mesi prima. I dettagli per il protocollo chirurgico sono discussi in studi precedenti12,13 e procedure simili sono state eseguite in altri protocolli precedentemente pubblicati14,15. La vascolarizzazione è etichettata con fluoresceina-destrano verde (70.000 MW, soluzione anionica, 2,5% p/v) iniettata per via endovenosa. Questo colorante è economico e facilmente disponibile da fonti commerciali, ma ha uno spettro di emissione più ampio che può sovrapporsi all’emissione RCaMP e sanguinare durante l’acquisizione di immagini al microscopio. I passaggi per l’unmixing spettrale sono descritti nella Sezione 4 di seguito per aggirare questo, ma possono essere utilizzati anche altri coloranti verdi con spettri di emissione più stretti, come quelli basati su EGFP.
Il presente metodo fornisce dettagli sull’iniezione della vena della coda del topo con un catetere, l’acquisizione di immagini al microscopio a due fotoni per pile di profondità, i filmati di segnalazione del calcio cellulare, la creazione di kymografi emodinamici e l’analisi del calcio e dell’emodinamica con i nostri algoritmi di elaborazione delle immagini17 (Figura 1). Ci sono diversi vantaggi di queste tecniche che migliorano il risultato dell’imaging in vivo e riducono il tempo, le risorse e lo stress animale durante la sessione. In primo luogo, l’uso di un catetere per l’iniezione della vena della coda fornisce un maggiore controllo sull’ago, sulla siringa e sulla quantità di sostanza iniettata nella circolazione del topo. Inoltre, impedisce l’iniezione di colorante nel tessuto della coda, risparmiando costosi reagenti. In secondo luogo, utilizziamo topi transgenici che esprimono sensori di calcio geneticamente codificati nei periciti che si avvolsero e dimostrano come localizzarli all’interno della rete vascolare cerebrale con uno z-stack di profondità, che facilita l’identificazione e il trasferimento delle cellule nelle successive sessioni di imaging a lungo termine. Questo è un fattore importante negli studi sui periciti e garantisce una corretta classificazione cellulare6,7. In terzo luogo, forniamo i nostri parametri per la raccolta di filmati di calcio e dati di scansione emodinamica della linea che sono un buon punto di partenza per misurare i segnali cellulari dinamici. Infine, presentiamo i nostri algoritmi di elaborazione delle immagini17, una cassetta degli attrezzi completa per l’elaborazione delle immagini che contiene più approcci per la pre-elaborazione delle immagini (come lo smixing spettrale), l’analisi delle immagini di calcio e l’analisi emodinamica (diametro, velocità, ecc.). Questi algoritmi possono generare grafici per una visualizzazione rapida e semplice dei dati, riducendo al minimo il livello di competenza dell’utente richiesto per analizzare i risultati. Inoltre, può essere automatizzato con poche righe di codice per elaborare rapidamente in batch più set di dati con gli stessi parametri. Ciò può potenzialmente migliorare la visualizzazione dei dati e l’investimento di tempo del ricercatore.
La chiave per raccogliere buoni dati di imaging del calcio è regolare la potenza del laser e le impostazioni PMT per una chiara acquisizione del segnale di fluorescenza, ma anche raccogliere dati a un frame rate sufficiente per catturare l’intero evento di calcio. I dati in questo protocollo sono stati acquisiti a 10-11 fotogrammi al secondo, che cattura le oscillazioni di calcio più lente nei periciti che si riscaldano. Ci sono anche diversi passaggi durante l’analisi che possono migliorare il risultato dell’analisi. In primo luogo, l’unmixing spettrale è utile se vi è una sovrapposizione significativa tra gli spettri di emissione dei fluorofori (Figura 2). La fluoresceina-destrano è stata utilizzata in questo protocollo perché è un coniugato destrano economico e disponibile in commercio che viene comunemente usato per le misurazioni emodinamiche5. L’unmixing spettrale aiuta a ripulire i dati per una migliore rilevazione dei segnali di calcio, ma potrebbero essere utilizzati anche fluorofori alternativi con spettri di emissione più stretti. In secondo luogo, la selezione manuale delle strutture cellulari come ROI (Figura 3) è utile per classificare gli eventi di calcio in diverse regioni subcellulari come il soma o i rami di processo. La selezione del ROI basata sull’attività (Figura 4)16 fornisce maggiori informazioni spaziali e temporali sui singoli eventi di calcio. Questo può essere utile quando si determina la frequenza degli eventi di calcio in una determinata area o la propagazione degli eventi ad altre aree cellulari. L’uso di software di programmazione per analizzare i dati di imaging può far risparmiare ai ricercatori ore di tempo quando i dati vengono elaborati in batch, ma richiede un investimento iniziale di tempo per regolare i parametri per risultati ottimali. I fattori più importanti sono la dimensione prevista (in μm2) della regione attiva e la durata del segnale (devono essere definiti il tempo minimo del segnale e il tempo massimo del segnale). I ricercatori devono prima esaminare alcuni film di esempio della serie T per determinare al meglio quali parametri si adattano ai loro dati. Infine, i dati di scarsa qualità acquisiti al microscopio possono ostacolare notevolmente l’analisi del calcio e dell’emodinamica (Figura 6). Pertanto, è necessario prestare attenzione per ottimizzare le impostazioni di acquisizione del microscopio all’inizio. Con questi fattori in mente, questo protocollo che può essere adattato per adattarsi all’imaging del calcio o all’analisi di altri segnali cellulari dinamici (ad esempio, sodio fluorescente, potassio, metabolita o fluttuazioni di tensione) in altri tessuti o tipi di cellule.
Esistono diverse limitazioni a questo protocollo. In primo luogo, i dati vengono raccolti in anestesia, che influisce sull’attività cerebrale e potrebbe influire sul flusso sanguigno. Immagini simili possono essere eseguite in topi svegli che sono addestrati ad accettare la fissazione della testa per risultati più fisiologici. Inoltre, è importante ricordare che raccogliamo immagini 2-dimensionali di una cellula tridimensionale e di un vaso sanguigno in vivo. Pertanto, possiamo catturare solo una fazione degli eventi di calcio all’interno di queste cellule o il flusso sanguigno in una singola sezione del vaso sanguigno alla volta.
Un’altra limitazione da notare è che l’imaging del calcio a due fotone è sensibile agli artefatti di movimento, in cui il movimento dentro e fuori dal piano focale può essere scambiato per fluttuazioni di calcio. Questo protocollo è stato eseguito in anestesia, che limita il movimento dell’animale; tuttavia, gli artefatti di movimento possono essere introdotti dalla frequenza respiratoria del topo, dalla frequenza cardiaca, dal possibile gonfiore dei tessuti e, nel caso di periciti incatenanti, contrazione dei vasi o vasomozione 4,6,18,19. Gli artefatti di movimento possono essere mitigati da diverse strategie. I pacchetti di elaborazione delle immagini utilizzati in questo protocollo includono una fase di correzione del movimento opzionale, che utilizza un motore di convoluzione 2D per allineare le immagini all’interno della serie T in base allavascolarizzazione visibile 13,17. I fotogrammi con cambiamenti significativi nel piano focale sono identificati da questo algoritmo e possono essere esclusi dall’analisi. Inoltre, è possibile utilizzare strategie statistiche all’interno dei pacchetti di elaborazione dell’imaging, come un punteggio Z quando si generano le tracce di fluorescenza per normalizzare le fluttuazioni di calcio indotte dal movimento20. L’approccio più robusto per tenere conto degli artefatti di movimento nell’imaging a due fotoli è quello di combinare l’espressione di due indicatori fluorescenti all’interno della stessa cellula, come un indicatore di calcio (ad esempio, GCaMP) e un reporter fluorescente (ad esempio, mCherry) che è indipendente dal calcio. Le fluttuazioni nel reporter fluorescente possono quindi essere attribuite al movimento e vengono sottratte dal segnale dell’indicatore del calcio per normalizzare gli artefatti di movimento.
Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire una chiara comprensione di come raccogliere dati ottimali di imaging del calcio e del flusso sanguigno in vivo e di presentare nuovi metodi e strumenti di analisi che i ricercatori possono implementare al fine di migliorare i loro risultati. Queste tecniche possono essere applicate per studiare il ruolo di diverse popolazioni di periciti nel controllo del flusso sanguigno o in diversi stati di malattia cerebrale. Questi parametri di imaging possono anche essere utilizzati per studiare il calcio e il flusso sanguigno in altri tipi di cellule e sistemi di organi e principi simili si applicano ad altre tecniche di imaging dinamico rese possibili da altri sensori geneticamente codificati, oltre al calcio.
The authors have nothing to disclose.
J. Meza è supportato da borse di studio di Mitacs e Research Manitoba. Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito da Canadian Institutes for Health Research, Research Manitoba, Manitoba Medical Service Foundation, finanziamenti di start-up dall’Università di Manitoba e Brain Canada attraverso il Canada Brain Research Fund, con il sostegno finanziario di Health Canada e Azrieli Foundation. Le opinioni qui espresse non rappresentano necessariamente le opinioni del Ministro della Salute o del Governo del Canada.
Acta2-RCaMP1.07 | The Jackson Laboratory | 28345 | In the video protocol the animal model used is a female mouse of 10 months, 1 day old. |
Applicators (Regular) | Bisco | X-80250P | |
BioFormats package for MATLAB | NA | NA | Denominated in this protocol as "image processing packages". Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/ |
CHIPS MATLAB toolbox | NA | NA | Denomitaded in this protocol as "image processing algorithms". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS |
Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity | HealthCare Plus | UGC250 | |
Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
Eye Lube Plus | Optixcare | NA | |
FIJI | Image J | NA | Denominated in this protocol as "image processor software". Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
GCaMP6sfl/fl | The Jackson Laboratory | ||
Head Post fixing platform | University of Zurich | NA | |
Ketamine (Narketan 100 mg/mL) | Vetoquinol | 440893 | |
MATLAB R2020b | NA | Denominated in this protocol as "programming platform ". Available in: https://www.mathworks.com/downloads/ | |
Needle 0.3mmx25mm | BD PrecisionGlide | 305128 | |
Objective XLUMPLFLN20XW | Olympus | NA | https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/ |
PDGFRβ-CreERT2 | The Jackson Laboratory | 30201 | |
Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11”) O.D. 61mm (.024”) | BD Intramedic | 427401 | |
Prairie View | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
Ultima In Vitro Multiphoton Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
Under Tank Heater | Reptitherm U.T.H | E169064 | |
Xylazine (Rompun 20 mg/mL) | Bayer HealthCare | 2169592 |