Farelerde Modelleme İnme: Dış Karotid Arter yoluyla Geçici Orta Serebral Arter Tıkanıklığı
Summary
Deneysel inme araştırmalarında orta serebral arter tıkanma (MCAo) farklı modelleri kullanılmaktadır. Burada, serebrovasküler trombüsin spontan pıhtı lizisi veya tedavisi nedeniyle çıkarıldığı insan inmesini taklit etmeyi amaçlayan dış karotis arter (ECA) yoluyla geçici MCAo’nun deneysel bir inme modeli tanımlanmıştır.
Abstract
İnme, gelişmiş ülkelerde üçüncü en sık mortalite nedeni ve edinilmiş erişkin sakatlığının önde gelen nedenidir. Bugüne kadar terapötik seçenekler inmeden sonraki ilk saatlerde inme hastalarının küçük bir oranı ile sınırlıdır. Özellikle terapötik zaman penceresini uzatmak için yeni terapötik stratejiler kapsamlı bir şekilde araştırılmaktadır. Bu güncel araştırmalar, inme sonrası inme sonrası inflamasyon, anjiogenez, nöronal plastisite ve rejenerasyon gibi önemli patofizyolojik yolların incelenmesini içerir. Son on yılda, bağımsız araştırma grupları arasında deneysel sonuçların ve bilimsel bulguların zayıf tekrarlanabilirliği konusunda artan bir endişe vardır. “Çoğaltma krizi” olarak adlandırılan krizin üstesinden gelmek için, tüm prosedürler için ayrıntılı standartlaştırılmış modellere acilen ihtiyaç vardır. “ImmunoStroke” araştırma konsorsiyumu (https://immunostroke.de/) içinde bir çaba olarak, geçici orta serebral arter tıkanıklığının (MCAo) standartlaştırılmış bir fare modeli önerildi. Bu model, filamentin çıkarılmasından sonra kan akışının tamamen restorasyonuna izin verir, insan felçlerinin büyük bir kısmında meydana gelen terapötik veya spontan pıhtı lizizini simüle eder. Bu “filament” inme modelinin cerrahi prosedürü ve fonksiyonel analizi için araçlar eşlik eden videoda gösterilmiştir.
Introduction
İnme, dünya çapında en sık görülen ölüm ve sakatlık nedenlerinden biridir. Esas olarak iskemik ve hemorajik olmak üzere iki farklı inme şekli olmasına rağmen, tüm inme vakalarının% 80-85’i iskemik1‘ dir. Şu anda, iskemik inme hastaları için sadece iki tedavi mevcuttur: rekombinant doku plazminojen aktivatörü (rtPA) veya mekanik trombektomi ile farmakolojik tedavi. Ancak terapötik zaman penceresinin dar ve çoklu dışlama kriterleri nedeniyle bu özel tedavi seçeneklerinden sadece belirli sayıda hasta yararlanabiliyor. Son yirmi yılda preklinik ve çevirisel inme araştırmaları nöroprotektif yaklaşımların incelenmesine odaklanmıştır. Bununla birlikte, klinik çalışmalara ulaşan tüm bileşikler şimdiye kadar hasta için hiçbir iyileşme göstermedi2.
İn vitro modeller inmenin tüm beyin etkileşimlerini ve patofizyolojik mekanizmalarını doğru bir şekilde üretemediğinden, hayvan modelleri preklinik inme araştırmaları için çok önemlidir. Bununla birlikte, tek bir hayvan modelinde insan iskemik inmenin tüm yönlerini taklit etmek mümkün değildir, çünkü iskemik inme son derece karmaşık ve heterojen bir hastalıktır. Bu nedenle farklı türlerde zamanla farklı iskemik inme modelleri geliştirilmiştir. Serebral arterioles fototombozu veya orta serebral arterin (MCA) kalıcı distal tıkanıklığı, neokortekste küçük ve lokal olarak tanımlanmış lezyonlara neden olan yaygın olarak kullanılan modellerdir3,4. Bunların yanı sıra, en sık kullanılan inme modeli muhtemelen MCA’nın geçici bir tıkanıklığının elde edildiği “filament modeli” olarak adlandırılır. Bu model, MCA’nın kökenine geçici bir dikiş filamentinin girişinden oluşur, bu da serebral kan akışının aniden azalmasına ve ardından subkortikal ve kortikal beyin bölgelerinin büyük enfarktürüne yol5. Çoğu kontur modeli MCA oklüzyonlarını taklit etse de 6, “filament modeli” iskemik zamanın hassas bir şekilde sınırlandırılmasına izin verir. Filament giderme ile reperfüzyon, spontan veya terapötik (rtPA veya mekanik trombektomi) pıhtı lizizi sonrası beyin kan akışı restorasyonunun insan klinik senaryosunu taklit eder. Bugüne kadar, bu “filament modelinin” farklı modifikasyonları tanımlanmıştır. En yaygın yaklaşımda, ilk olarak Longa ve ark. 19895yılında, MCA7’ninkökenine ortak karotis arter (CCA) aracılığıyla silikon kaplı bir filament tanıtılır. Yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olmasına rağmen, bu model reperfüzyon sırasında kan akışının tamamen geri yüklenmesine izin vermez, çünkü CCA filamentin çıkarılmasından sonra kalıcı olarak bağlanır.
Son on yılda, giderek artan sayıda araştırma grubu, bu “filament modelini” kullanarak farelerde inme modellemeye ilgi duyuyor. Bununla birlikte, bu modelin önemli değişkenliği ve prosedürlerin standardizasyonunun olmaması, şimdiye kadar bildirilen deneysel sonuçların ve bilimsel bulguların yüksek değişkenliğinin ve zayıf tekrarlanabilirliğinin nedenlerinden bazılarıdır2,8. Araştırma laboratuvarları arasındaki düşük tekrarlanabilirlik oranına atıfta bulunan mevcut “çoğaltma krizinin” potansiyel bir nedeni, aynı deneysel metodolojiyi kullanan araştırma grupları arasındaki karşılaştırılamaz inme enfarktüs hacimleridir9. Aslında, ilk preklinik randomize kontrollü çok merkezli deneme çalışmasını yaptıktan sonra10, bu deneysel inme modelinin yeterli standardizasyonunun olmamasının ve sonraki sonuç parametrelerinin bağımsız laboratuvarlar arasındaki preklinik çalışmalarda tekrarlanabilirliğin başarısızlığının ana nedenleri olduğunu doğrulayabildik11 . Ortaya çıkan enfarktüs boyutlarındaki bu şiddetli farklılıklar, aynı inme modelini kullanmasına rağmen, sadece doğrulayıcı araştırmalar için değil, aynı zamanda sağlam ve tekrarlanabilir modellerin eksikliği nedeniyle bilimsel işbirlikleri için de haklı bir tehdit oluşturmaktadır.
Bu zorluklar ışığında, “ImmunoStroke” araştırma konsorsiyumu (https://immunostroke.de/) içindeki işbirlikçi araştırma çalışmalarında kullanılan standartlaştırılmış geçici BIR MCAo modeli prosedürünü ayrıntılı olarak geliştirmeyi ve tanımlamayı amaçladık. Bu konsorsiyum, inme iyileşmesinin mekanistik ilkelerinin altında kalan beyin-bağışıklık etkileşimlerini anlamayı amaçlamaktadır. Ayrıca inme sonuç analizi için histolojik ve ilgili fonksiyonel yöntemler sunulmaktadır. Tüm yöntemler, ImmunoStroke konsorsiyumunun tüm araştırma laboratuvarlarında kullanılan yerleşik standart işletim prosedürlerine dayanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol, standartlaştırılmış geçici bir MCAo modeli oluşturmak için bir Alman çok merkezli araştırma konsorsiyumunun (“ImmunoStroke”) konsensüs anlaşmasına dayanan deneysel bir inme modelini tanımlamaktadır. MCA’nın kökenine ECA üzerinden silikon kaplı bir filament getirilerek kurulan geçici MCAo modeli, sınırlandırılmış bir tıkanıklık döneminden sonra arteriyel reperfüzyon elde etmek için en yaygın kullanılan inme modellerinden biridir. Bu nedenle, bu yordam çeviriyle ilgili b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ImmunoStroke Konsorsiyumu’nun (FOR 2879, For immune cells to stroke recovery) tüm işbirliği ortaklarımıza öneriler ve tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı), Münih Sistem Nörolojisi Kümesi (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) çerçevesinde ve LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 ve LL-112/1-1 hibeleri kapsamında Almanya’nın Mükemmellik Stratejisi kapsamındadır.
Materials
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
- O’Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice – middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
