Генерация почечных тубулоидов человека из тканей и мочи

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты, описанные в настоящем документе, были одобрены медицинским этическим комитетом Медицинского центра Эразма (Роттердам, Нидерланды) и Центром детской онкологии принцессы Максимы (Утрехт, Нидерланды). 1. Генерация почечных тубулоидов человека из ткани Материалы Предваряемые многоязычные пластины для культивирование тканей (6, 12 и 24 скважины) на ночь при 37 °C. Готовят базальную среду (AdDF+++), добавляя 1x добавку L-аланина/L-глутамина, 1% мас./v 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин этанесульфоновую кислоту (HEPES, 10 мМ) и 1% пенициллин/стрептомициновые антибиотики к Advanced DMEM/F12. Готовят культуральную среду, добавляя 1,5% добавки B27, 10% R-спондин-кондиционированную среду, эпидермальный фактор роста (50 нг/мл), фактор роста фибробластов-10 (100 нг/мл), N-ацетилцистеин (1,25 мМ), ингибитор ро-киназы Y-27632 (10 мкМ), антибиотики широкого спектра действия (0,1 мг/мл) и A83-01 (5 мкМ) к AdDF+++. Перед использованием нагревают до 37 °C. Приготовьте экстракт базальной мембраны (BME), разморозив аликвоту на ночь при 4 °C. Держите BME на льду во время процедуры. Готовят раствор коллагеназы путем разведения коллагеназы до конечной концентрации 1 мг/мл в AdDF+++, с добавлением 10 мкМ Y-27632. Прогреть до 37 °C. Приготовьте 10 см чашки Петри, скальпели и пинцет. Продезинфицируйте посуду, применяя ультрафиолетовую лампу в течение 20 мин, с последующим промыванием дезинфицирующим средством, полуводой и 70% v/v этанола. Высушите посуду на воздухе. Предваренный горизонтальный шейкер до 37 °C. Процедура Соберите почечную ткань в пробирке 50 мл, заполненной 30-40 мл среды AdDF+++. Поместите кусочек ткани в ~1 мл среды в чашку Петри 10 см. Измерзайте ткань на кусочки размером ~1 мм3 с помощью скальпелей(рисунок 1А). Переложите измельченную ткань в трубку 15 мл с помощью щипцов и скальпелей. Добавьте 5 мл AdDF+++ в чашку Петри, вымойте и соберите среду стерильной пипеткой 10 мл. Переложите все это содержимое в одну трубку. Центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре и удаляют супернатант. Добавьте 3-4 мл раствора коллагеназы в пробирку 15 мл. Переместите трубку в горизонтальный шейкер, установленный при 37 °C и скорости 250 об/мин. После первых 15 мин инкубации проверьте образец и энергично встряхните трубку. Повторяют до тех пор, пока суспензия не будет однородной и большинство кусочков ткани не исчезнут, с максимальным временем инкубации 45-60 мин.(Рисунок 1В). Заполните трубку AdDF+++ и перемешайте, перевернив трубку в 5-10 раз. Центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при 4 °С и удаляют супернатант. Если гранула красного цвета, перейдите к шагу 1.2.6. В противном случае перейдите к шагу 1.2.8. Добавьте 1 мл буфера лизиса эритроцитов (см. Таблицу материалов)поверх клеточной гранулы. Осторожно постучите по трубке, чтобы повторно суспендировать гранулу (не повторно суспендируйте с помощью наконечника пипетки). Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Заполните трубку AdDF+++. Центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при 4 °С и удаляют супернатант. Если клетки крови все еще видны, повторите процедуру еще раз, начиная с шага 1.2.6. В противном случае перейдите к шагу 1.2.8. Если в этой точке протокола видны куски ткани, перейдите к шагу 1.2.8. В противном случае приступайте к измерению объема гранул на этапе 1.2.9. Добавьте 5 мл AdDF+++ в пробирку и повторно суспендировать 10 мл стерильной пипеткой. Фильтруйте суспензию через ситечко нейлоновых клеток толщиной 100 мкм, помещенное на трубку 50 мл. Перенесите отфильтрованную суспензию в новую трубку 15 мл. Центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при 4 °С и удаляют супернатант. Измерьте объем ячейки гранулы с помощью пипетки p1000, установленной на известный объем. Осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать, не создавая пузырьков воздуха. Переложить трубку на лед на 1 мин. Добавьте 70-75% объема BME в гранулу. Повторное суспендирование с использованием пипетки p1000 или p200 и пластины капель 15 мкл в предварительно разоплавленной многоязычной клеточной культуральной пластине (6, 12 или 24 скважины, исходя из общего объема гальванировки (200 мкл, 6 скважин)). Переверните тарелку вверх дном, и дайте пластине покоиться в инкубаторе в течение 15-20 мин при 37 °C(рисунок 1C). Добавьте предварительно распавленную питательную среду и осмотрите культуры(рисунок 1С,D). 2. Генерация почечных тубулоидов человека из мочи ПРИМЕЧАНИЕ: Моча является враждебной средой для клеток. Для успешного выполнения этого протокола важно, чтобы образцы мочи обрабатывались как можно скорее, предпочтительно в течение 4 ч от выведения. В то же время образцы мочи должны храниться при 4 °C. Материалы Предваряемые многоязычные пластины для культивирование тканей (6, 12 и 24 скважины) на ночь при 37 °C. Приготовить моющее средство: AdDF+++ дополнено антибиотиками широкого спектра действия (0,1 мг/мл) и 10 мкМ Y-27632. Подготовьте культурную среду, как описано выше. Разогрейте при 37 °C перед использованием. Подготовьте матрицу BME. Держите на льду во время процедуры. Процедура Соберите образец мочи и разделите его поровну на пробирки по 50 мл(рисунок 2А-I). Добавьте 10-20 мл моющее средство в каждую из пробирок. Центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C(рисунок 2A-II)и осторожно удаляют супернатант. Добавьте 10 мл моющее средство в каждый из пробирок. Тщательно повторно суспендируете гранулы, используя стерильную пипетку 10 мл. Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C(рисунок 2A-III)и осторожно удаляют супернатант. Повторно суспендируют гранулы и переложите содержимое всех пробирок в одну трубку объемом 15 мл. Наполните трубку моющее средство. Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C(рисунок 2A-IV)удаляют и удаляют супернатант. Измерьте объем ячейки гранулы с помощью пипетки p1000, установленной на известный объем. Осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать, не создавая пузырьков воздуха. Переложить трубку на лед на 1 мин. Добавьте 70-75% объема BME в гранулу. Повторное суспендирование с использованием пипетки p1000 или p200 и пластины капель 15 мкл в предварительно разоплавленной многоязычной клеточной культуральной пластине (6, 12 или 24 скважины, исходя из общего объема гальванировки (200 мкл, 6 скважин)). Переверните тарелки вверх дном в инкубаторе на 15-20 мин при 37 °C. Добавьте предварительно высупленную питательную среду и осмотрите культуры(рисунок 2B). 3. Расширение тубулоидных культур ПРИМЕЧАНИЕ: Тубулоидные культуры можно проходить примерно каждые 1-2 недели с соотношением расщепления 1:2-1:3. Они обычно могут быть расширены примерно на 15 проходов с вариациями, специфичными для линии. Материалы Предваряемые многоязычные пластины для культивирование тканей (6, 12 и 24 скважины) на ночь при 37 °C. Подготовьте базальную среду (AdDF+++) и держите ее на льду во время процедуры. Подготовьте культурную среду, как описано выше. Прогрейте до 37 °C перед использованием. Подготовьте матрицу BME и держите на льду во время процедуры. Готовят трипсиновый заместитель с добавлением Y-27632 до концентрации 10 мкМ. Перед применением нагревают до 37 °C. Автоклавные нефильтрованные наконечники p10. Охладите центрифугу до 4 °C. Процедура Разрушайте капли, содержащие тубулоиды, пипеткой вверх и вниз пипеткой p1000 с использованием среды, присутствующей в скважине. Используйте наконечник, чтобы соскрести дно колодца, убедившись, что собраны все ячейки, прикрепленные к дну. Соберите содержимое в пробирку объемом 15 мл. Добавьте 10 мл AdDF+++. Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C и удалите супернатант. В зависимости от размера гранулы, добавьте заместитель трипсина, дополненное 10 мкМ Y-27632. Используйте 1 мл заменителя трипсина на 200 мкл капель BME, содержащих тубулоиды. Инкубировать при 37 °C в течение 5 мин. Используйте пипетку p1000 с наконечником и вставьте нефильтрованный, стерильный наконечник p10 поверх наконечника 1000 мкл. Пипетка вверх и вниз в течение 20-30 раз, чтобы механически нарушить работу органоидов. Проверьте под микроскопом, чтобы увидеть, много ли неповрежденных органоидов все еще присутствуют в трубке(рисунок 3A). Если в этой точке присутствует более 10% интактных органоидов, повторите от 5-минутной инкубации на этапе 3.2.3 до микроскопического наблюдения за интактными органоидами на этапе 3.2.5 еще раз. В противном случае перейдите к шагу 3.2.6. Заполните трубку AdDF+++. Центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при 4 °С и удаляют супернатант. Измерьте объем ячейки гранулы с помощью пипетки p1000, установленной на известный объем. Осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать, не создавая пузырьков воздуха. Переложить трубку на лед на 1 мин. Добавьте 70-75% объема BME в гранулу. Повторное суспендирование с использованием пипетки p1000 или p200 и пластины капель 15 мкл в предварительно разоплавленной многоязычной клеточной культуральной пластине (6, 12 или 24 скважины, исходя из общего объема гальванировки (200 мкл, 6 скважин)). Переверните тарелки вверх дном, и дайте пластине отдохнуть в инкубаторе в течение 15-20 мин при 37 °C. Добавьте предварительно высупленную питательную среду и осмотрите культуры(рисунок 3В).