المجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري لديناميكيات الكالسيوم في شرائح أنسجة البنكرياس الحادة للفأر
Summary
نقدم إعداد شرائح أنسجة البنكرياس الحادة واستخدامها في المجهر المجهري للمسح بالليزر البؤري لدراسة ديناميكيات الكالسيوم في وقت واحد في عدد كبير من الخلايا الحية ، على مدى فترات زمنية طويلة ، وبدقة مكانية زمانية عالية.
Abstract
شريحة أنسجة البنكرياس الحادة للفئران هي إعداد فريد من نوعه في الموقع مع الاتصالات بين الخلايا المحفوظة وبنية الأنسجة التي تنطوي على تغييرات أقل بكثير من المستحضر من الجزر المعزولة أو الأسيني أو القنوات أو الخلايا المشتتة الموصوفة في الدراسات النموذجية في المختبر. من خلال الجمع بين شريحة أنسجة البنكرياس الحادة وتصوير الكالسيوم للخلايا الحية في المجهر الضوئي بالليزر البؤري (CLSM) ، يمكن دراسة إشارات الكالسيوم في عدد كبير من خلايا الغدد الصماء والإفرازات الخارجية في وقت واحد ، بدقة خلية واحدة أو حتى دون الخلية. تسمح الحساسية بالكشف عن التغيرات وتمكن من دراسة الموجات بين الخلايا والاتصال الوظيفي وكذلك دراسة اعتماد الاستجابات الفسيولوجية للخلايا على توطينها داخل الجزيرة وعلاقة paracrine مع الخلايا الأخرى. أخيرا ، من منظور رعاية الحيوان ، فإن تسجيل الإشارات من عدد كبير من الخلايا في وقت واحد يقلل من عدد الحيوانات المطلوبة في التجارب ، مما يساهم في مبدأ استبدال 3R وتقليله وصقله.
Introduction
البنكرياس الثدييات هو إفرازات كبيرة وغدة صماء. يشكل الجزء الخارجي 96-99٪ من إجمالي حجم البنكرياس ويتكون من الأسيني والقنوات. يتكون جزء الغدد الصماء من عدد كبير من جزر لانغرهانز التي تمثل 1-4٪ المتبقية من إجمالي حجم البنكرياس1. يفرز الجزء الخارجي إنزيمات هضمية رئيسية تكسر البوليمرات الغنية بالطاقة في الطعام ، بالإضافة إلى سائل غني بالبيكربونات ، والذي يتحد مع إفرازات الجهاز الهضمي الأخرى لتوفير بيئة مناسبة لعمل الإنزيمات. يفرز جزء الغدد الصماء الهرمونات التي تنظم التوزيع والتخزين والإطلاق بين الأكل للمغذيات الغنية بالطاقة. على الرغم من أن الأنسجة الخارجية متخلفة نسبيا والغدد الصماء متطورة نسبيا عند الولادة ، إلا أن الأولى سرعان ما تتضخم في الأخيرة عند الفطام2،3،4. تميزت الدراسات المبكرة لوظيفة البنكرياس بولادة علم وظائف الأعضاء الحديث ، وقد أعقبت التطورات المنهجية الرئيسية في هذا المجال اختراقات علمية رئيسية5. يعد العمل مع البنكرياس تحديا تقنيا بسبب البنية المعقدة للغدة ، ولكنه أيضا دافع كبير بسبب أمراض مثل سرطان البنكرياس والتهاب البنكرياس والسكري التي تشكل تهديدات كبيرة للصحة العامة ، والتي تحتاج إلى نهج علاجية جديدة.
تم تطوير الجزر المعزولة6 و acini7,8 وشظايا القنوات واستخدامها لعقود كطرق قياسية ذهبية بسبب مزاياها مقارنة بخطوط الخلايا وخلايا الغدد الصماء الأولية المشتتة و acinar و ductal cells 9,10. على الرغم من التحسن الملحوظ في وظيفة مجموعات الخلايا المعزولة ، إلا أن هذه الطرق لا تزال تنطوي على إجهاد ميكانيكي وإنزيمي كبير ، وتعزل الخلايا عن الأنسجة المحيطة ، وبالتالي تفتقر إلى تفاعلات paracrine والدعم الميكانيكي ، والأهم من ذلك ، أنها مصحوبة بتغييرات كبيرة في علم وظائف الأعضاء الطبيعي11,12,13 . تم تطوير شريحة أنسجة البنكرياس الحادة للفئران في عام 2001 بدافع الحاجة المتصورة لتطوير منصة تجريبية مشابهة لشرائح الدماغ والغدة النخامية والغدة الكظرية مع الاتصالات المحفوظة بين الخلايا ، وتفاعلات paracrine ، واللحمة المتوسطة ، وبنية الأنسجة ، وكذلك بدون بعض أهم أوجه القصور في الطريقة القياسية الذهبية في أبحاث الجزر في ذلك الوقت – الجزر المعزولة12 ، 14. ومن بين أوجه القصور هذه الأضرار التي لحقت بالطبقات الخارجية، وعدم إمكانية الوصول إلى مناطق الجزر الأساسية، والحاجة إلى الزراعة مع تأثيرات مهمة محتملة على هوية الخلية وعلم وظائف الأعضاء12،15. علاوة على ذلك ، تتيح طريقة شرائح الأنسجة إجراء دراسات على النماذج الحيوانية ذات بنية الجزر المختلة بشكل كبير حيث يستحيل عزل الجزر ، أو عندما يكون محصول الجزر منخفضا للغاية من خلال العزل التقليدي16،17،18،19،20،21.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن الشريحة أكثر ملاءمة لدراسة التغيرات المورفولوجية أثناء تطور مرض السكري والتهاب البنكرياس ، على سبيل المثال ، لأنها تمكن من إلقاء نظرة عامة أفضل على الأنسجة بأكملها ومتوافقة أيضا مع دراسة الاختلافات الإقليمية. الأهم من ذلك ، على الرغم من التركيز المبكر على جزء الغدد الصماء ، فإن طريقة شريحة الأنسجة تمكن بطبيعتها من دراسة مكونات الإفرازات9،22،23. خلال العقد الأول بعد إدخالها ، تم استخدام الطريقة للدراسات الكهروفسيولوجية لخلايا بيتا14،24،25،26،27،28،29 وألفا30،31 وكذلك لفحص النضج المورفولوجي والوظيفي للبنكرياس2،3 . بعد عقد من الزمان في عام 2013 ، تم تكييف الطريقة بنجاح لتصوير الكالسيوم في الخلايا الحية للخلايا الجزرية باستخدام CLSM لتوصيف استجاباتها للجلوكوز32 ، وأنماط الاتصال الوظيفية 33 ، والعلاقة بين إمكانات الغشاء والكالسيوم داخل الخلايا من خلال الجمع بين صبغة الكالسيوم الفلورية مع صبغة غشاء محتمل34. في وقت لاحق من نفس العام ، تم استخدام الطريقة أيضا لتقييم ديناميكيات الكالسيوم في الخلايا الأسينار22,35. على مدى السنوات التالية ، تم استخدام شرائح أنسجة البنكرياس في عدد من الدراسات المختلفة وتكييفها بنجاح مع الخنازير والأنسجة البشرية9،36،37،38،39،40،41. ومع ذلك ، إذا أخذنا معا ، فإن تصوير الكالسيوم – في شرائح أنسجة البنكرياس الفأرية بشكل عام وفي الجزر بشكل خاص – لا يزال يتم تنفيذه في الغالب من قبل هذه المجموعة. قد يكمن أحد الأسباب الرئيسية لذلك في الجمع بين إعداد شريحة الأنسجة الصعبة تقنيا ، والحاجة إلى مجهر بؤري ، وتحليل البيانات المعقدة إلى حد ما. والهدف الرئيسي من هذه الورقة هو جعل هذه الطريقة القوية في متناول المستخدمين المحتملين الآخرين.
هناك بالفعل بعض المقالات المنهجية الممتازة التي تتعامل بالتفصيل مع إعداد شرائح الأنسجة واستخدام الشرائح للدراسات الهيكلية والإفرازات ، ولكن ليس لتصوير الكالسيوم البؤري9،42،43. لذلك ، تركز هذه الورقة على بعض النصائح والحيل الإضافية أثناء إعداد الشرائح ، وعلى الخطوات الحاسمة لتحميل الصبغة بنجاح ، والحصول على الصور ، وكذلك على الخطوات الرئيسية لتحليل بيانات الكالسيوم الأساسية. ولذلك، ينبغي النظر إلى هذه المساهمة على أنها مكملة للطريقة المذكورة أعلاه وليست بديلا لها. وبالمثل ، يجب النظر إلى تصوير الكالسيوم في شرائح أنسجة البنكرياس الفأرية على أنه نهج تجريبي يستخدم للإجابة على أسئلة محددة ، وبالتالي فهو مكمل بدلا من أن يكون بديلا مطلقا لنهج تصوير الكالسيوم الأخرى في فسيولوجيا البنكرياس مثل القنوات المعزولة أو الأسيني ، والجزر المعزولة ، والمواد العضوية ، والجزر المزروعة في الغرفة الأمامية للعين ، والتسجيلات في الجسم الحي11،44،45،46،47،48. ربما يكون أفضل دليل على وعد تصوير الكالسيوم في شرائح أنسجة البنكرياس الفأرية هو التسجيلات الناجحة الأخيرة لديناميات الكالسيوم في الخلايا الوسيطة الجزرية مثل pericytes49 و macrophages50 ، وكذلك في الخلايا القنية23.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة شريحة أنسجة البنكرياس هي طريقة تجريبية سريعة لدراسة مورفولوجيا وفسيولوجيا أجزاء الغدد الصماء والإفرازات الخارجية من البنكرياس في إعداد أكثر حفظا في الموقع. وقد سبق الإشارة إلى العديد من المزايا في المقدمة. تجدر الإشارة إلى أنه بشكل عام (أي ليس فقط لتصوير الكالسيوم) ، فإن نهج الشريحة لدراسة فسيولوجيا البنكرياس يوفر الوقت لأنه لا ينطوي على فترة نقاهة بعد العزلة. هذا الأخير ليس ضروريا للغاية مع جميع أنواع التجارب واستخدامات الجزر المعزولة من أنواع مختلفة ، ولكنه يستخدم عادة لزيادة النقاء ، واستعادة الجدوى والوظائف ، وأحيانا لجمع الجزر من عدة جهات مانحة 59,60,61,62,63,64 . ومع ذلك ، في سياق تصوير الكالسيوم ، تم العثور على استجابات خلايا بيتا تعتمد على مدة وظروف الزرع ، وهذا مصدر مهم للاختلاف الذي يجب مراعاته عند استخدام الجزر المعزولة15,65. يجب النظر في نفس المشكلة بالنسبة لشرائح الأنسجة إذا أصبحت ثقافتها طويلة الأجل خيارا مستخدما على نطاق واسع في المستقبل22,36. تتميز طريقة شريحة الأنسجة أيضا بغلة عالية وبالتالي من المحتمل أن تقلل من معاناة الحيوانات وتزيد من القوة الإحصائية. علاوة على ذلك ، حيث يمكن تحضير العديد من الشرائح من واحد ولأن الشرائح تبقى على قيد الحياة لفترات طويلة ، بما في ذلك نفس الحيوان أو حتى نفس الجزيرة في كل من المجموعات التجريبية والضابطة يصبح ممكنا.
نظرا للحفاظ على البنية الأصلية والاتصالات من خلية إلى خلية ، ولأنها متوافقة مع عدد من التحليلات الهيكلية ، والفيزيولوجيا الكهربية ، وطرق التصوير ، وفحوصات إفراز الهرمونات ، فإن هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة وظائف البنكرياس التي تعتمد على التفاعلات غير المضطربة بين الخلايا الفردية ، على سبيل المثال ، الحساسية للإفراز ، paracrine والتفاعلات المناعية بين أنواع الخلايا المختلفة ، أنماط النشاط الكهربائي ، وخصائص ديناميكيات الكالسيوم ، وإفراز الهرمونات المختلفة. بالنسبة لتصوير الكالسيوم على وجه التحديد ، تتمثل المزايا الرئيسية لاستخدام الشرائح في تعرض قلب الجزيرة وإمكانية الحصول على إشارات من العديد من أنواع الخلايا المختلفة بدقة عالية. اعتمادا على متطلبات التجربة وعمر الحيوانات ، يمكن أن يختلف السمك ، ويمكن نقل الشرائح ، أو الحصول عليها من الحيوانات مع مراسلين مشفرين وراثيا. وكما هو موضح بمزيد من التفصيل أدناه، فإن النهجين الأخيرين يمكنان أيضا من تحديد وتوصيف وظيفي محدد للاستجابات من الخلايا غير بيتا 31,66. علاوة على ذلك ، يمكن دراسة الجزر من أجزاء محددة جيدا من العضو للاختلافات في الاستجابة أو القابلية للأمراض. على الرغم من أنها لا تتطلب فترة حضانة للتعافي ، إلا أنه يمكن احتضانها بسهولة بعوامل دوائية مختلفة ، وأحماض دهنية ، ونسبة عالية من الجلوكوز ، والسيتوكينات.
الأهم من ذلك ، نظرا لأن الدقة العالية قابلة للتحقيق بالاقتران مع دقة أحادية الخلية أو حتى دون الخلوية ، فإن تصوير الكالسيوم البؤري في شرائح هو أحد أنسب الطرق لتحليل موجات الكالسيوم ، والاتصال الوظيفي ، والأدوار الوظيفية المختلفة للخلايا في أجزاء متميزة من جزيرة54,67. على الرغم من عدد من المزايا ، فإن نهج شريحة الأنسجة له قيود مهمة. أولا ، لا يزال مدمرا جزئيا على الأقل لبنية الجزيرة والإفرازات ، خاصة على السطح المقطوع ، وهناك حاجة إلى احتياطات ، مثل درجة الحرارة المنخفضة ، والتبادل المتكرر للحلول ، والتلاعب اللطيف والسريع ، أثناء التحضير لمنع حدوث أضرار إنزيمية ميكانيكية وداخلية إضافية. ثانيا ، لا تزال أنماط توصيل المغذيات والإفرازات أقل شأنا من الطريق في الجسم الحي ، ويتم فصل المستحضر عن التعصيب الجهازي ، وردود الفعل بين الأعضاء ، مثل بين الجزيرة وأنسجتها المستهدفة ، مستحيلة ، على عكس النهج في الجسم الحي. ثالثا ، الحد الأقصى لسمك الشريحة محدود بالأوكسجين ، وتوصيل المغذيات ، وتنظيم درجة الحموضة عند ~ 200 ميكرومتر9. علاوة على ذلك ، يحتاج كل من إعداد الشرائح والتصوير إلى الكثير من التدريب ، وتتطلب التحليلات المتعمقة لبيانات الكالسيوم من سلاسل زمنية طويلة ومن العديد من الخلايا معرفة متخصصة لا يتم تضمينها في كثير من الأحيان في مجموعة أدوات عالم فسيولوجي كلاسيكي وتتطلب مساعدة من الفيزيائيين أو علماء البيانات. ميزة الحفاظ على التفاعلات المثلية وغير المتجانسة يمكن أن تعقد أيضا تحليل العينات بسبب وجود إشارات من خلايا أخرى في المناطق ذات الاهتمام. اعتمادا على البروتوكولات ، يمكن أن يؤدي تنشيط الخلايا الأخرى إلى تحفيز إضافي غير مباشر أو تثبيط خلية مرصودة.
ولا يمكن حل هذه المشكلة بشكل قاطع إلا من خلال نهج إزالة الالتفاف، وبروتوكولات التحفيز الأكثر تعقيدا بما في ذلك المواد التي تمنع بعض الآثار غير المباشرة، وباستخدام محددة بالضربة القاضية، ومن خلال المقارنة الدقيقة للنتائج مع نتائج الدراسات الأخرى التي تستخدم منهجيات أكثر اختزالا. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت قياسات الإفراز ضرورية ، فيجب أن يؤخذ في الاعتبار أن بعض الشرائح قد تفتقر إلى الجزر ، وأن الكتلة الإجمالية لأنسجة الغدد الصماء في شريحة واحدة عادة ما تكون منخفضة. يتضمن إعداد شرائح أنسجة البنكرياس الحادة للتصوير العديد من الخطوات الحاسمة التي تمت مناقشتها في الأقسام التالية وملخصة في الجدول 1 ، حيث يمكن للقارئ أيضا العثور على نصائح قصيرة ولكنها مهمة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولا ، عند تحضير محلول الأغاروز ، يجب أن يذوب مسحوق الأغاروز تماما ، وإلا فإن الجسيمات غير الذائبة قد تعيق الحقن. حافظ على محلول الأغاروز المتجانس عند 37-45 درجة مئوية لمنع تصلب الأغاروز بسبب درجة الحرارة المنخفضة جدا من ناحية ولمنع تلف الأنسجة بسبب درجات الحرارة المرتفعة جدا من ناحية أخرى. بعد الاستخدام ، يمكن تخزين الأغاروز المتبقي عند 4 درجات مئوية وإعادة تسخينه ، على الرغم من أن إعادة التسخين المتكررة يمكن أن تؤدي إلى زيادة الكثافة بسبب تبخر الماء ، مما يجعل الحقن صعبا أو مستحيلا في النهاية.
الخطوة الحاسمة التالية في التحضير هي تثبيت الحليمة الاثني عشر الرئيسية بشكل صحيح. تشير البقعة البيضاء على الاثني عشر إلى تقاطع القناة الصفراوية المشتركة والاثني عشر. سيؤدي المشبك الذي يتم وضعه بالقرب جدا إلى انسداد بعض فروع البنكرياس الجانبية للقناة المشتركة ، مما يؤدي إلى تعطيل حقن هذه الأجزاء ، في حين أن المشبك الذي يتم وضعه بعيدا جدا سيؤدي إلى تسرب الأغاروز عبر مسار المقاومة السفلي مباشرة إلى الاثني عشر. قبل تقليب القناة الصفراوية المشتركة ، يمكن إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة بعناية للحصول على تصور أفضل للقناة وتحكم أكبر أثناء الحقن. قد تؤدي الدقة غير الكافية أثناء إزالة الأنسجة المحيطة إلى ثقب القناة. اختيار قطر الإبرة المستخدمة لحقن الأغاروز مهم أيضا. في الفئران ، يفضل استخدام إبرة 30 جم ؛ تتطلب الإبر الأصغر (32 أو 33 جم) مزيدا من الجهد بسبب اللزوجة العالية لمحلول الأغاروز وهي أكثر عرضة للانسداد. ومع ذلك ، إذا تم استخدامها مع محلول أغاروز منخفض الكثافة ، فيمكن أن تكون مفيدة جدا في سلالات الفئران الأصغر والحيوانات الأصغر سنا. خلال الأيام الأولى بعد الولادة ، يمكن بدلا من ذلك حقن الأغاروز تحت المحفظة بدلا منداخل القناة 2. من المرجح أن يؤدي استخدام الإبر ذات القطر الأكبر في الفئران إلى إتلاف القناة الصفراوية الشائعة. يمكن أن يحدث هذا أيضا مع قطر الإبرة الصحيح ، ويمكن أن يساعد الملقط في الحفاظ على الإبرة في مكانها أثناء الحقن. قد تكون الإبر ذات القطر الأكبر هي الحل الوحيد في حالة القنوات الأكبر ، كما هو الحال في الفئران. إذا كانت الإبرة ضيقة جدا بحيث لا تضمن وجود ختم محكم يمنع التسرب الخلفي، فقد يتم وضع رباط حولها عند الدخول بنجاح إلى القناة.
يستغرق حقن الأغاروز بعض الجهد بسبب لزوجة المحلول ، وبمجرد بدء عملية الحقن ، لا ينبغي مقاطعته لأن محلول الأغاروز منخفض الانصهار قد يتصلب في الإبرة أو أكبر أجزاء شجرة الأقنية قبل اكتمال الحقن. سيؤدي ذلك إلى ضعف اختراق الأنسجة ودعم أسوأ أثناء القطع. يجب دائما تعليب القناة عند النقطة التي تنضم فيها القناة الكبدية اليسرى والقناة الكيسية لتشكيل القناة الصفراوية المشتركة. إذا تم ثقب القناة الصفراوية المشتركة ، فحاول مرارا وتكرارا أن تقصف بالقرب من الاثني عشر. عندما يتم تثبيت البنكرياس بما فيه الكفاية بمحلول الأغاروز واستخراجه من التجويف البريتوني ، يتم قطع قطع صغيرة من الأنسجة المحقونة جيدا. قبل تضمينها في الأغاروز ، من الضروري إزالة جميع الأنسجة الدهنية والضامة لأن بقاياها تجعل التقطيع أكثر تحديا. وينطبق الشيء نفسه على الأوعية الدموية وبقايا القنوات ، إلا عندما تكون محور التجربة. في هذه الحالة ، تأكد من وضعها بطريقة يتم فيها الحصول على المقطع العرضي المطلوب. عند تضمين الأنسجة في الأغاروز ، تأكد من أن درجة الحرارة مناسبة (37 درجة مئوية) ، وأن الأنسجة محاطة بالكامل بالأغاروز ، حيث يمكن للقوى أثناء تقطيع الاهتزاز أن تمزق أنسجة البنكرياس من كتل الأغاروز.
يمكن أن يساعد تجفيف كتل الأنسجة بسرعة قبل وضعها في الأغاروز عن طريق وضعها لفترة وجيزة على منديل ورقي في منع ضعف الاتصال بين الأنسجة والأغاروز خلال هذه الخطوة. أثناء تصلب كتل الأغاروز ، ضع طبق بتري أفقيا ، ومنع الاتصال بين أنسجة البنكرياس والجزء السفلي من طبق بتري. إذا لم يتم حقن البنكرياس بالكامل ، فستكون عملية القطع صعبة. لذلك ، حاول تقليل سرعة القطع للحصول على شرائح الأنسجة. لتقليل تلف الخلايا أثناء تقطيع الاهتزاز ، استبدل ECS (ومكعبات الثلج المصنوعة من ECS) في غرفة التقطيع بانتظام. هذا الأخير سوف يقلل من نشاط إنزيمات البنكرياس التي يتم إطلاقها من الأنسجة الأسينية أثناء التقطيع. سمك الشرائح له أهمية حاسمة أيضا. بالنسبة لديناميات الكالسيوم والتجارب الكهروفسيولوجية ، عادة ما يتم قطع شرائح 140 ميكرومتر ؛ ومع ذلك ، وفقا للهدف من الدراسة ، يمكن أن يتراوح سمك الشريحة من 90 ميكرومتر إلى 200 ميكرومتر. ضع في اعتبارك أنه في الشرائح الأكثر سمكا ، سيكون انتشار الأكسجين والمواد المغذية محدودا ، ولكنه سيشمل المزيد من الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتوقع أن تزداد نسبة الجزر غير المقطوعة مع زيادة سمك الشريحة. يمكن تخزين الشرائح في ECS متبادلة بانتظام في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات أو حتى زراعتها في وسط خلية مناسب لعدة أيام ؛ ومع ذلك ، قد يؤثر هذا في النهاية على فسيولوجيا الخلايا الجزرية الطبيعية 3,22.
عند تحضير محلول الصبغة ، تأكد من الخلط الدقيق لجميع المكونات ، وتجنب التعرض للضوء المحيط. تتكون شريحة البنكرياس من العديد من طبقات الخلايا ، ويقتصر امتصاص صبغة الكالسيوم على طبقات الخلايا القليلة الأولى الأكثر سطحية ، كما هو موضح سابقا للجزر المعزولة58,68 ، وشرائح الغدة النخامية 69. ومع ذلك ، على عكس الجزر المعزولة حيث تعيق الكبسولة المحيطة وطبقات الخلايا الخارجية تغلغل الصبغة في طبقات أعمق ، تسمح شرائح الأنسجة بالوصول إلى كامل سطح المقطع العرضي للجزيرة ، مما يتيح قياسا متزامنا لديناميكيات الكالسيوم في مئات الخلايا من جميع طبقات الجزيرة. مؤشرات Fluorescent Ca2+ هي الأكثر استخداما على نطاق واسع لقياس ديناميكيات الكالسيوم ، وجنبا إلى جنب مع CLSM ، فإنها تمكن التسجيلات بدقة زمنية عالية ، تصل إلى عدة مئات من الهرتز. عند اختيار مؤشر Ca2+ الفلورسنت الأنسب ، ضع في اعتبارك عوامل مختلفة ، بما في ذلك شكل المؤشر ، الذي يؤثر على طريقة تحميل الخلية ، ووضع القياس (النوعي أو الكمي) ، وثابت التفكك (Kd) الذي يجب أن يكون في نطاق تركيز Ca 2 + ذي الأهمية ويعتمد على درجة الحموضة ودرجة الحرارة ووجود Mg2 + والأيونات الأخرى ، وكذلك ربط البروتين. نظرا لأن إشارات Ca 2+ الخلوية عادة ما تكون عابرة ، فيجب أيضا مراعاة ثابت معدل ارتباط Ca2+. لقياس ديناميكيات [Ca 2+] IC في خلايا البنكرياس ، تستخدم هذه المجموعة بشكل أساسي صبغة مؤشر Ca2+ النفاذة للخلية الموضحة في هذا البروتوكول (جدول المواد) لأنها مؤشر طول موجي طويل مع الأطوال الموجية للانبعاثات في الطيف حيث يكون التألق الذاتي الخلوي عادة أقل إشكالية ، وطاقة ضوء الإثارة منخفضة ، مما يقلل من احتمال حدوث تلف ضوئي خلوي. نظرا لأن هذه الصبغة فلورية بتركيزات منخفضة من Ca2+ ، فإن هذا يسهل تحديد خط الأساس [Ca2 +] IC ويزيد من الرؤية الخلوية قبل التحفيز. بعد ربط Ca2+ ، تزداد شدة التألق للصبغة 14 ضعفا ، مما يتيح اكتشاف تغييرات طفيفة في [Ca2 +] IC.
لنجاح تصوير الكالسيوم في الخلايا الحية ، يجب النظر في العديد من معلمات الأجهزة الحاسمة ، كما هو موضح في قسم البروتوكول. بالنسبة لتصوير الخلايا الحية حيث تكون سعات الإشارة منخفضة وفرص السمية الضوئية عالية ، يفضل استخدام الأهداف ذات NA الأعلى لجمع المزيد من الضوء من العينة. إذا كان يجب تسجيل ديناميكيات الكالسيوم بدقة زمنية عالية ، فاستخدم الماسح الضوئي الرنان بدلا من الجلفانومتر الخطي. إلى جانب اختيار الهدف الصحيح ، فإن استخدام أجهزة الكشف عالية الحساسية – مثل أجهزة الكشف الهجينة التي تتطلب طاقة ليزر أقل – يتجنب السمية الضوئية والتبييض الضوئي. هذا له أهمية خاصة لتصوير الكالسيوم طويل الأمد. الخطوات الهامة الأخرى في تصوير الكالسيوم هي إعدادات المعلمات لجودة الصورة لعمليات الاستحواذ على السلاسل الزمنية. أهمها الدقة الزمنية والمكانية. وبما أن ديناميات الكالسيوم في حد ذاتها تحدد أدنى دقة زمنية مقبولة، يجب أن يكون معدل أخذ العينات أعلى بضعفين على الأقل من تردد الإشارة المتوقع للكشف عن الإشارة أو حتى أعلى 10 مرات للكشف عن شكل الإشارة بشكل موثوق. في شرائح أنسجة البنكرياس الحادة ، يمكن قياس ديناميكيات الكالسيوم في مئات الخلايا في وقت واحد ، وبالتالي ، فإن الدقة المكانية مهمة أيضا. يمكن تعزيز ذلك عن طريق زيادة عدد وحدات البكسل أو عن طريق زيادة متوسط الخط أثناء الاكتساب المباشر. ومع ذلك ، بسبب العلاقة العكسية بين الدقة المكانية والزمنية ، هناك حاجة إلى المفاضلة بين كلا الإعدادين.
إذا كان لا بد من إجراء تصوير الكالسيوم في مجموعة خلايا معينة داخل البنكرياس ، فمن الضروري وجود حافز قادر على التمييز وظيفيا بين الخلايا داخل الشريحة. الجلوكوز العالي ينشط خلايا بيتا بشكل موثوق وسريع إلى نمط تذبذبي يتم فرضه على مستوى مرتفع من الكالسيوم ويتم تزامنه بشكل كبير بين جميع الخلايا داخل جزيرة 32,58,70. خلايا بيتا هي أكثر أنواع الخلايا عددا داخل الجزيرة وتقع في الغالب في قلب الجزيرة في الفئران. ينخفض نفس بروتوكول التحفيز وأحيانا لا يغير بشكل ملحوظ الانفجار في خلايا ألفا 30،32،58،70،71،72. للتمييز بين خلايا ألفا وظيفيا ، يمكن استخدام الجلوكوز المنخفض (3 ملليمتر) أو الغلوتامات أو الأدرينالين لزيادة ترددها أو القاعدية [Ca 2+] IC21,72,73,74,75. وهي تمثل 10-20٪ من الخلايا الجزيرية وسيتم اكتشافها على محيط الجزيرة1. تم العثور على خلايا دلتا أيضا على الأطراف. وهي تشكل فقط ~ 5٪ من إجمالي عدد خلايا الغدد الصماء في الجزيرة وعادة ما تكون نشطة في الجلوكوز 6 mM وتستجيب لتحفيز الجلوكوز مع زيادة نشاط الانفجار غير المنتظم من خط الأساس أو مستوى الكالسيوم المرتفع قليلا 1,32,71,76. يمكن استخدام الجريلين لتحفيز محدد لخلايا دلتا21،77،78،79 في تجارب تصوير الكالسيوم. ومع ذلك ، لا يزال يتعين تحديد بروتوكولات لتحديد وظيفي محدد لخلايا PP و epsilon. علاوة على ذلك ، 25 نانومتر أستيل كولين ينشط بشكل موثوق الخلايا الأسينار في نشاط انفجار35،80،81. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام عدد من الإفرازات الأخرى ، مثل cerulein و cholecystokinin و carbamylcholine ، لاستحضار استجابات الكالسيوم في الخلايا الأسينار22,40,82,83.
أخيرا ، يستحضر حمض شينوديوكسيكوليك 1 mM استجابات الكالسيوم بشكل موثوق في الخلايا القنية في شرائح الأنسجة. يمكن أيضا استخدام الأنجيوتنسين II و ATP وبعض الإفرازات الأخرى11،23،84،85. عندما لا يكون التحديد الوظيفي القائم على الاستجابات المميزة لإفرازات ومثبطات محددة كافيا ، يمكن استخدام الحيوانات المصنفة وراثيا 31 أو الخلايا المنقولة73 أو الكيمياء المناعية لتحديد أنواع الخلايا المختلفة 9,22,71,86 . خلال العامين الماضيين ، تم تكييف طريقة شريحة الأنسجة بنجاح مع الأنسجة البشرية ، مما فتح العديد من الطرق البحثية المهمة الجديدة في كل من إفرازات41 وفسيولوجيا الغدد الصماء9،36،37،39. ومن المثير للاهتمام أن إجراء تقييم مفصل لديناميات الكالسيوم في الجزر البشرية كان صعبا للغاية ولا يزال يتعين التحقيق فيه بمزيد من التفصيل87. جنبا إلى جنب مع المجهر البؤري المتقدم ، مكنت طريقة شريحة أنسجة البنكرياس من العديد من الأفكار الجديدة في ديناميكيات الكالسيوم في الفئران ونأمل أن تفعل الشيء نفسه بالنسبة للأنسجة البشرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل المقدم في هذه الدراسة ماليا من قبل وكالة البحوث السلوفينية (رقم التمويل الأساسي للبحوث. P3-0396 و I0-0029 ، بالإضافة إلى أرقام المشاريع البحثية. J3-9289 و N3-0048 و N3-0133) ومن قبل صندوق العلوم النمساوي / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (المنح الثنائية I3562–B27 و I4319–B30). ونشكر ماروشا روشر وماسا تشاتر ورودي ملاكار على المساعدة التقنية الممتازة.
Materials
| Equipment | |||
| Analytical balance KERN ALJ 120-4 | KERN & SOHN GmbH | ALJ 160-4A | |
| Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup | Leica | 5100001578 | |
| Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup | Leica | ||
| Cork pad 15 cm x 15 cm | |||
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430790 | |
| Corning Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Fischer Scientific, Leicestershire, UK | 432124 | |
| Double edge razor blade | Personna, USA | ||
| Dumont #5 – Fine Forceps | FST, Germany | 11254-20 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL | Eppendorf | 0030 121.023 | |
| Erlenmeyer flask 200 mL | IsoLab, Germany | 027.01.100 | |
| Fine Scissors – ToughCut | FST, Germany | 14058-11 | |
| Flat orbital shaker IKA KS 260 basic | IKA | Ident. No.: 0002980200 | |
| Glass lab bottle 1000 mL | IsoLab, Germany | 091.01.901 | |
| Hartman Hemostat, curved | FST, Germany | 13003-10 | |
| HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0) | Leica | 15507701 | |
| Measuring cylinder 25 mL | IsoLab, Germany | 015.01.025 | |
| Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7 | Luigs & Neumann | 200-100 900 7311, 200-100 900 9050 | |
| Microwave owen | Gorenje, Slovenia | MO20MW | |
| Osmometer Gonotec 010 | Gonotec, Berlin, Germany | OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20 | |
| Paint brush | Faber-Castell, No.2 | Any thin soft round paint brush No.2, preferably black | |
| Paper towels | |||
| Perifusion pumps | Ismatec | ISM 827 | Reglo Analog MS – 4/8 |
| Petri dish 100/20 mm | Sarstedt | 83.3902 | |
| Petri dish 35/10 mm | Greiner bio-one | 627102 | |
| Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | 153066 | NON-STICKY for agarose blocks |
| pH meter inoLab pH Level 1 | WTW, Weilheim, Germany | E163694 | |
| Pipette 1000 mL | Eppendorf | 3121 000.120 | |
| Pipette 50 mL | Eppendorf | 3121 000.066 | |
| Push pins 23 mm | Deli, Ningbo, China | E0021 | |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Semken Forceps | FST, Germany | 11008-13 | |
| Stabilizing ring for Erlenmeyer flask | IsoLab, Germany | 027.11.048 | |
| Stereomicroscope Nikon SMZ 745 | Nikon, Melville, NY USA | ||
| Syringe Injekt Solo 5 mL | Braun, Melsungen, Germany | 4606051V | |
| Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2") | Braun, Melsungen, Germany | 4656300 | |
| Temperature controller | Luigs & Neumann | 200-100 500 0150, 200-150-500-145 | Slice mini chamber, Temperature controller TC 07 |
| Tubings for perifusion system | Ismatec | SC0310 | Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD) |
| Ultrasonic bath Studio GT-7810A | Globaltronics | ||
| Vibrotome Leica VT 1000 S | Leica, Nussloch, Germany | 14047235613 | |
| Volumetric flask 1000 mL | IsoLab, Germany | 013.01.910 | |
| Vortex mixer Neolab 7-2020 | Neolab | 7-2020 | |
| Water bath Thermo Haake open-bath circulator | Thermo Fisher Scientific | Z527912 | |
| Material/Reagent | |||
| Calcium chloride dihydrate – CaCl2.2H2O | Sigma Aldrich, Germany | C5080-500G | |
| D-(+)-glucose | Sigma Aldrich, Germany | G8270-1KG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540-100ML | |
| DL-lactic acid | Sigma Aldrich, Germany | L1250-500ML | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | D8662-500ML | |
| Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure | |||
| Glue Wekem sekundenkleber WK-110 | Wekem GmbH, Bergkamen, Germany | WK 110-020 | |
| HEPES | Sigma Aldrich, Germany | H3375-250G | |
| L-(+)-ascorbic acid | Sigma Aldrich, Germany | A9,290-2 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | L3224 | |
| Magnesium chloride hexahydrate – MgCl2.2H2O | Sigma Aldrich, Germany | M2670-500G | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich, Germany | I5125-100G | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1, AM | Invitrogen (Thermo FisherScientific) | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm) |
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | P3000MP | polaxamer: nonionic triblock copolymer |
| Potassium chloride – KCl | Sigma Aldrich, Germany | 31248 | |
| SeaPlaque GTG agarose | Lonza, Rockland, USA | 50111 | |
| Sodium bicarbonate – NaHCO3 | Honeywell, Germany | 31437-500G | |
| Sodium chloride – NaCl | Honeywell, Germany | 31434-1KG | |
| Sodium hydroxide – NaOH | Sigma Aldrich, Germany | 30620 | |
| Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4 | Sigma Aldrich, Germany | S0751-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich, Germany | 15990-100G | |
| Software | |||
| FIJI | FIJI is an open source project | ||
| LASAF | Leica microsystems, Inc. | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Python | Python Software Foundation | Python is an open source project |
References
- Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e1024405 (2015).
- Meneghel-Rozzo, T., Rozzo, A., Poppi, L., Rupnik, M. In vivo and in vitro development of mouse pancreatic ß-cells in organotypic slices. Cell and Tissue Research. 316 (3), 295-303 (2004).
- Rozzo, A., Meneghel-Rozzo, T., Delakorda, S. L., Yang, S. B., Rupnik, M. Exocytosis of insulin: in vivo maturation of mouse endocrine pancreas. Annals of the New York Academy of the Sciences. 1152, 53-62 (2009).
- Dolenšek, J., Pohorec, V., Rupnik, M. S., Stožer, A., Seicean, A. Pancreas physiology, challenges in pancreatic pathology. IntechOpen. , (2017).
- Williams, J. A. The nobel pancreas: a historical perspective. Gastroenterology. 144 (6), 1166-1169 (2013).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. American Journal of Physiology. 235 (5), 517-524 (1978).
- Peikin, S. R., Rottman, A. J., Batzri, S., Gardner, J. D. Kinetics of amylase release by dispersed acini prepared from guinea pig pancreas. American Journal of Physiology. 235 (6), E743-E749 (1978).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 105-113 (2010).
- Molnar, R., et al. Mouse pancreatic ductal organoid culture as a relevant model to study exocrine pancreatic ion secretion. Laboratory Investigation. 100 (1), 84-97 (2020).
- Rupnik, M. The physiology of rodent beta-cells in pancreas slices. Acta Physiologica (Oxford, England). 195 (1), 123-138 (2009).
- Blinman, T. A., et al. Activation of pancreatic acinar cells on isolation from tissue: cytokine upregulation via p38 MAP kinase. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 279 (6), C1993-C2003 (2000).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic ß-cells. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 446 (5), 553-558 (2003).
- Gilon, P., Jonas, J., Henquin, J. Culture duration and conditions affect the oscillations of cytoplasmic calcium concentration induced by glucose in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 37 (10), 1007-1014 (1994).
- Huang, C., Gu, G. Effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), e55160 (2017).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (7), e255 (2007).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1125 (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1343 (2009).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4137 (2012).
- Hamilton, A., Vergari, E., Miranda, C., Tarasov, A. I. Imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (153), (2019).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS ONE. 8 (11), e78706 (2013).
- Gal, E., et al. A Novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
- Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. KATP-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar ATP. Molecular and Cellular Endocrinology. 230 (1-2), 51-58 (2005).
- Speier, S., Gjinovci, A., Charollais, A., Meda, P., Rupnik, M. Cx36-mediated coupling reduces β-cell heterogeneity, confines the stimulating glucose concentration range, and affects insulin release kinetics. Diabetes. 56 (4), 1078-1086 (2007).
- Rose, T., Efendic, S., Rupnik, M. Ca2+-secretion coupling is impaired in diabetic Goto Kakizaki rats. The Journal of General Physiology. 129 (6), 493-508 (2007).
- Paulmann, N., et al. Intracellular serotonin modulates insulin secretion from pancreatic β-cells by protein serotonylation. PLoS Biology. 7 (10), e1000229 (2009).
- Mandic, S. A., et al. Munc18-1 and Munc18-2 proteins modulate β-cell Ca2+ sensitivity and kinetics of insulin exocytosis differently. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 28026-28040 (2011).
- Dolensek, J., Skelin, M., Rupnik, M. S. Calcium dependencies of regulated exocytosis in different endocrine cells. Physiological Research. 60, S29-S38 (2011).
- Huang, Y. C., Rupnik, M., Gaisano, H. Y. Unperturbed islet α-cell function examined in mouse pancreas tissue slices. Journal of Physiology. 589 (2), 395-408 (2011).
- Huang, Y. C., et al. In situ electrophysiological examination of pancreatic α cells in the streptozotocin-induced diabetes model, revealing the cellular basis of glucagon hypersecretion. Diabetes. 62 (2), 519-530 (2013).
- Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (1), e54638 (2013).
- Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), e1002923 (2013).
- Dolenšek, J., Stožer, A., Skelin Klemen, M., Miller, E. W., Slak Rupnik, M. The relationship between membrane potential and calcium dynamics in glucose-stimulated beta cell syncytium in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (12), e82374 (2013).
- Perc, M., Rupnik, M., Gosak, M., Marhl, M. Prevalence of stochasticity in experimentally observed responses of pancreatic acinar cells to acetylcholine. Chaos. 19 (3), 037113 (2009).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265-3265 (2020).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525 (2020).
- Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
- Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
- Klemen, M., Dolenšek, J., Stožer, A., Rupnik, M., Thorn, P. . Exocytosis Methods. 7, 127-146 (2014).
- Speier, S. Experimental approaches for high-resolution in vivo imaging of islet of Langerhans biology. Current Diabetes Reports. 11 (5), 420-425 (2011).
- Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Molecular Metabolism. 6 (9), 1002-1009 (2017).
- Reissaus, C. A., et al. A Versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 8449 (2019).
- Jacob, S., et al. In vivo Ca(2+) dynamics in single pancreatic beta cells. FASEB Journal. 34 (1), 945-959 (2020).
- Fernandez, J., Valdeolmillos, M. Synchronous glucose-dependent [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans recorded in vivo. FEBS Letters. 477 (1-2), 33-36 (2000).
- Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metabolism. 27 (3), 630-644 (2018).
- Weitz, J. R., et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released ATP to monitor beta cell activity. Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).
- Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in α- and β-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
- Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
- Santos, R. M., et al. Widespread synchronous Ca oscillations due to bursting electrical activity in single pancreatic islets. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 418 (4), 417-422 (1991).
- terk, M., et al. Assessing the origin and velocity of Ca2+ waves in three-dimensional tissue: Insights from a mathematical model and confocal imaging in mouse pancreas tissue slices. Communications in Nonlinear Science and Numerical Simulation. 93, 105495 (2021).
- Gosak, M., et al. Critical and supercritical spatiotemporal calcium dynamics in beta cells. Frontiers in Physiology. 8, 1106 (2017).
- Satin, L. S., Butler, P. C., Ha, J., Sherman, A. S. Pulsatile insulin secretion, impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Molecular Aspects in Medicine. 42, 61-77 (2015).
- Tengholm, A., Gylfe, E. Oscillatory control of insulin secretion. Molecular and Cellular Endocrinology. 297 (1-2), 58-72 (2009).
- Quesada, I., et al. Glucose induces opposite intracellular Ca2+ concentration oscillatory patterns in identified α- and β-cells within intact human islets of Langerhans. Diabetes. 55 (9), 2463-2469 (2006).
- Ferguson, J., Allsopp, R. H., Taylor, R. M., Johnston, I. D. Isolation and long term preservation of pancreatic islets from mouse, rat and guinea pig. Diabetologia. 12 (2), 115-121 (1976).
- Andersson, A. Isolated mouse pancreatic islets in culture: effects of serum and different culture media on the insulin production of the islets. Diabetologia. 14 (6), 397-404 (1978).
- Ramirez-Dominguez, M. Isolation of mouse pancreatic islets of Langerhans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 938, 25-34 (2016).
- Carter, J., Dula, S., Corbin, K., Wu, R., Nunemaker, C. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11 (1), 3-31 (2009).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplantation. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Zawalich, W. S., Yamazaki, H., Zawalich, K. C. Biphasic insulin secretion from freshly isolated or cultured, perifused rodent islets: comparative studies with rats and mice. Metabolism. 57 (1), 30-39 (2008).
- Roe, M. W., et al. Absence of effect of culture duration on glucose-activated alterations in intracellular calcium concentration in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 38, 876-877 (1995).
- Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflügers Archive. European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
- Dolenšek, J., et al. Glucose-dependent activation, activity, and deactivation of beta cell networks in acute mouse pancreas tissue slices. bioRxiv. , (2020).
- QZhang, Q., et al. Cell coupling in mouse pancreatic beta-cells measured in intact islets of Langerhans. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 366 (1880), 3503-3523 (2008).
- Sánchez-Cárdenas, C., Hernández-Cruz, A. GnRH-induced Ca2+-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
- Asada, N., Shibuya, I., Iwanaga, T., Niwa, K., Kanno, T. Identification of alpha- and beta-cells in intact isolated islets of Langerhans by their characteristic cytoplasmic Ca2+ concentration dynamics and immunocytochemical staining. Diabetes. 47 (5), 751-757 (1998).
- Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified α-, β- and δ-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (1), 85-93 (1999).
- Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
- Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
- Li, J., et al. Submembrane ATP and Ca2+ kinetics in α-cells: unexpected signaling for glucagon secretion. FASEB Journal. 29 (8), 3379-3388 (2015).
- Hamilton, A., et al. Adrenaline stimulates glucagon secretion by Tpc2-dependent Ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic α-cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
- Arrojo, E. D. R., et al. Structural basis for delta cell paracrine regulation in pancreatic islets. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
- Rorsman, P., Huising, M. O. The somatostatin-secreting pancreatic δ-cell in health and disease. Nature reviews. Endocrinology. 14 (7), 404-414 (2018).
- Petersen, C. C., Toescu, E. C., Petersen, O. H. Different patterns of receptor-activated cytoplasmic Ca2+ oscillations in single pancreatic acinar cells: dependence on receptor type, agonist concentration and intracellular Ca2+ buffering. The EMBO journal. 10 (3), 527-533 (1991).
- Thorn, P., Lawrie, A. M., Smith, P. M., Gallacher, D. V., Petersen, O. H. Local and global cytosolic Ca2+ oscillations in exocrine cells evoked by agonists and inositol trisphosphate. Cell. 74 (4), 661-668 (1993).
- Behrendorff, N., Floetenmeyer, M., Schwiening, C., Thorn, P. Protons released during pancreatic acinar cell secretion acidify the lumen and contribute to pancreatitis in mice. Gastroenterology. 139 (5), e1711-e1715 (2010).
- Criddle, D. N., et al. Cholecystokinin-58 and cholecystokinin-8 exhibit similar actions on calcium signaling, zymogen secretion, and cell fate in murine pancreatic acinar cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (6), G1085-G1092 (2009).
- Venglovecz, V., et al. Effects of bile acids on pancreatic ductal bicarbonate secretion in guinea pig. Gut. 57 (8), 1468-3288 (2008).
- Maleth, J., Hegyi, P. Calcium signaling in pancreatic ductal epithelial cells: an old friend and a nasty enemy. Cell Calcium. 55 (6), 337-345 (2014).
- Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified alpha-, beta- and delta-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (Pt 1), 85-93 (1999).
- Skelin Klemen, M., Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).
