JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Alomtegenwoordige en weefselspecifieke RNA-targeting in Drosophila Melanogaster met CRISPR/CasRx

Published: February 05, 2021
doi:
10.3791/62154
, , , ,
1Division of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology,University of California

Summary

Dit artikel schetst een gedetailleerd protocol voor het gebruik van het RNA-targeting Cas13D-enzym (RfxCas13D) in vliegen.

Abstract

CasRx, een lid van de RNA-targeting Cas13-familie, is een veelbelovende nieuwe toevoeging van de CRISPR / Cas-technologieën in efficiënte gentranscriptreductie met een aantrekkelijk off-target profiel op zowel cellulair als organismaal niveau. Onlangs is gemeld dat het CRISPR /CasRx-systeem kan worden gebruikt om alomtegenwoordige en weefselspecifieke gentranscriptreductie in Drosophila melanogaster te bereiken. Dit artikel beschrijft de methoden uit het recente werk, bestaande uit drie delen: 1) alomtegenwoordige in vivo endogene RNA-targeting met behulp van een tweecomponenten CasRx-systeem; 2) alomtegenwoordige in vivo exogene RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem; en 3) weefselspecifieke in vivo RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem. De effecten van waargenomen RNA-targeting omvatten gerichte genspecifieke fenotypische veranderingen, gerichte RNA-transcriptreductie en incidentele letaliteitsfenotypen geassocieerd met hoge expressie van CasRx-eiwit en collaterale activiteit. Over het algemeen toonden deze resultaten aan dat het CasRx-systeem in staat is om op een programmeerbare en efficiënte manier RNA-transcriptreductie op organismeniveau te targeten, wat aantoont dat in vivo transcriptoomtargeting en engineering haalbaar is en de basis legt voor toekomstige in vivo CRISPR-gebaseerde RNA-targetingtechnologieën.

Introduction

Sinds de komst van Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) technologieën, is veel van de focus op dit gebied gericht op DNA-bewerking, die transformatieve toepassingen biedt in de geneeskunde en biotechnologie1. Permanente verandering van DNA-sequenties is echter niet altijd gewenst vanwege ethische overwegingen. In het licht hiervan begonnen recente studies met het ontwikkelen van CRISPR-gebaseerde hulpmiddelen voor het richten van RNA en toonden aan dat CRISPR-technologieën inderdaad kunnen worden gebruikt voor RNA-targeting in een verscheidenheid aan biologische systemen2,3,4,5,6,7. In veel van deze geteste systemen is de huidige veelgebruikte aanpak voor het richten op RNA en transcriptreductie RNA-interferentie (RNAi), die verre van perfect is en vaak een gevarieerde werkzaamheid en hoge off-target activiteit vertoont bij gebruik in vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Daarom is het, gezien de status van deze technologieën, de moeite waard om de mogelijkheden van CRISPR-gebaseerde tools voor RNA-targeting verder te onderzoeken.

Een opmerkelijke recente studie meldde dat ribonuclease CasRx, een lid van de Cas13d-klasse, de gentranscriptieniveaus in menselijke celkweek efficiënt kan verlagen en een aantrekkelijk off-target profiel heeft4. Deze bevinding leidde tot de vraag of dit nieuwe ribonuclease zijn werkzaamheid en lage off-target rate voor RNA-targeting op organismeniveau kan behouden. Een recente studie beantwoordde deze vraag door aan te tonen dat het CasRx-systeem kan worden gebruikt om alomtegenwoordige en weefselspecifieke gentranscriptreductie in Drosophila melanogaster5 te bereiken.

Om de bruikbaarheid van deze onlangs gepubliceerde aanpak te stroomlijnen, beschrijft dit protocol de methoden uit dit recente werk, dat bestaat uit drie hoofdonderdelen: 1) alomtegenwoordige in vivo RNA-targeting met behulp van een tweecomponenten CasRx-systeem; 2) alomtegenwoordige in vivo exogene RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem; en 3) weefselspecifiekin vivo RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem.

Gids-RNA’s (gRNA) gericht op verschillende doelgenen onder controle van een alomtegenwoordige promotor werden ontworpen en vlieglijnen die deze gRNA-bevattende constructies tot expressie brengen, werden gegenereerd. CasRx-constructies onder controle van een alomtegenwoordige promotor of een voorwaardelijke upstream activation sequence (UASt) promotor die kan worden geactiveerd door de GAL4-transcriptiefactor, werden ook ontworpen en vliegen lijnen die deze CasRx-bevattende constructies bevatten gegenereerd. Katalytisch inactieve CasRx-constructies, dCasRx, werden ontworpen en gebruikt als negatieve controles. Alomtegenwoordige RNA-targeting in vliegen wordt bereikt door gRNA-tot expressie brengende vlieglijnen te kruisen met alomtegenwoordige CasRx-uitdrukkende vlieglijnen. Het nageslacht dat zowel het gRNA-construct tot expressie brengt dat zich richt op een specifiek gentranscript als het CasRx-eiwit, heeft een alomtegenwoordige reductie van gerichte gentranscripten. Weefselspecifieke RNA-targeting in vliegen wordt bereikt door eerst gRNA-tot expressie brengende vliegen te kruisen met UASt-CasRx die vliegen tot expressie brengt, waarbij transheterozygote vliegen worden verkregen die zowel gRNA- als UASt-CasRx-constructies dragen. Dergelijke vliegen worden op hun beurt gekruist met weefselspecifieke GAL4-tot expressie brengende vliegen, wat resulteert in het genereren van weefselspecifieke CasRx-expressie en RNA-targeting bij vliegen.

De programmeerbare aard van het CasRx-systeem biedt de mogelijkheid van aanpassing en optimalisatie om een hoge werkzaamheid en lage off-target activiteit te bereiken voor in vivo RNA-targeting. Potentiële toepassingen van CRISPR-gebaseerde RNA-targeting zijn talrijk, waaronder het vervangen van RNAi in het laboratorium en het bijdragen aan insectenvectorcontrole in het wild. Van de laatste is een van de wereldwijde onvervulde behoeften de ontwikkeling van efficiënte hulpmiddelen om infecties van RNA-virussen die via muggen worden overgedragen, te bestrijden. Veel RNA-virussen, zoals dengue, Zika en chikungunya-virus, worden overgedragen via muggen, waardoor de menselijke gezondheid wordt beïnvloed en sterfte wordt bijgedragen. Er zijn veel voorstellen gedaan voor het engineeren van muggenpopulaties met virusresistentie voor ziektepreventie; geen enkele huidige technologie is echter in staat om muggen tegelijkertijd resistent te maken tegen alle belangrijke RNA-virussen18,19,20,21,22,23. RNA-targeting Cas-systemen kunnen een startpunt bieden voor een dergelijke technologie door een programmeerbaar platform mogelijk te maken voor het richten op alle door muggen overgedragen RNA-virussen.

Protocol

1. Alomtegenwoordige in vivo RNA-targeting met behulp van een tweecomponenten CasRx-systeem Genereren van Ubiq-CasRx en Ubiq-dCasRx expressievector Versterk de CasRx-sequentie met behulp van een polymerasekettingreactie (PCR) met primer 1050E. C3 en 1050E. C4 en de originele CasRx constru pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx); en versterk de dCasRx-sequentie met PCR met primer 1050E. C3 en 1050E. C4 en de oorspronkelijke dCasRx construeren pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)4 (Tabel 1). Gelzuiver de versterkte CasRx- en dCasRx-fragmenten daarna met behulp van een gelzuiveringskit. Verteer base vector (Addgene plasmid #112686) met restrictie enzymen SwaI en PacI24. Gebruik in de resulterende producten een kit om het grotere fragment, dat de basisvectorbackbone wordt genoemd, te gelzuiveren. Monteer de Ubiq-CasRx-vector met de basisvectorbackbone en het CasRx-fragment met behulp van de Gibson-assemblagemethode; monteer de Ubiq-dCasRx-vector met de basisvectorbackbone en het dCasRx-fragment met behulp van de Gibson-assemblagemethode25.OPMERKING: De Addgene ID van de Ubiq-CasRx vector (OA-1050E) is #132416, en de Addgene ID van Ubiq-dCasRx vector (OA-1050R) is #132417. GRNA-expressievector genereren Ontwerp elk gRNA-fragment op basis van de volgende criteria: doelsequentie met een lengte van 30 nucleotiden; de maximale lengte van poly-U-rekoefeningen in de doelsequentie is 4 basenparen; het GC-gehalte van de doelreeks ligt tussen 30% en 70%; de doelsequentie waarvan werd voorspeld dat deze geen sterke RNA-haarspeldstructuren zou vormen; en de doelsequentie met minimaal voorspelde secundaire of tertiaire structuur van RNA5.OPMERKING: Deze studie ontwierp elk gRNA als 4 tandemsequenties van elk 30 nucleotiden lang, verdeeld over 36 nucleotide lange directe herhalingen, en met een 7-thymine terminator aan beide uiteinden5. Voor het exogene doelgen, GFP, werden dezelfde criteria als hierboven gevolgd met een toevoeging van een OpIE2-GFP-fragment5. Versterk de U6:3 promotorsequentie met behulp van PCR met primers 1043.C1 en 1043.C23 en de Addgene plasmide #112688 (Tabel 1)26. Gelzuiver de versterkte U6:3-fragmenten met behulp van een gelzuiveringskit. Digest Addgene plasmide #112688 met restrictie-enzym AscI en XbaI24. Gebruik in de resulterende producten een kit om de grotere fragmenten te gelzuiveren, wat de pre-base vector backbone wordt genoemd. Monteer de basisvector met de pre-base vector backbone en het U6:3 fragment met behulp van de Gibson assemblage methode25. De basisvector hierna heet OA-1043.OPMERKING: De Addgene ID van plasmide OA-1043 is #164586. Synthetiseer het gRNA-fragment van het doelgen met behulp van externe gensynthesediensten. Verteer de basisvector OA-1043 met restrictie-enzym PstI en NotI24. Bewaar het hele verteringsproduct, dat digested OA-1043 wordt genoemd. Assembleer gRNA-expressievector met het verteerde OA-1043 en doelgengRNA-fragment met behulp van de Gibson-assemblagemethode25.OPMERKING: Vier doelgenen werden bestudeerd: drie waren endogeen (wit, Notch, geel), één was exogene (GFP). Hun Addgene ID’s zijn: #132420 (gRNAw), #132421(gRNAN), #132425 (gRNAy) en #133304 (gRNAGFP). Transgene vliegen genereren Injecteer expressievectoren in vliegenembryo’s met behulp van externe vliegenembryo-injectieservice en embryo’s van vliegen die ØC31-integratieplaatsen bevatten. Kweek de geïnjecteerde embryo’s bij 26 °C.OPMERKING: De attp40w (met integratieplaatsen op het 2e chromosoom) lijn werd gebruikt om CasRx lijnen te genereren en 8622 (met integratie sites op 3e chromosoom) lijn werd gebruikt om verschillende gRNA lijnen te genereren. Houd de vliegen als homozygote lijnen of als evenwichtige heterozygote lijnen.OPMERKING: Ubiq-CasRx en Ubiq-dCasRx vliegen werden gehouden als heterozygote gebalanceerde lijnen met de CyO als balancer. Bovendien bevatten zowel Ubiq-CasRx- als Ubiq-dCasRx-vectoren een dsRed-marker. Als gevolg hiervan hebben de Ubiq-CasRx- en Ubiq-dCasRx-vliegen de volgende drie fenotypen: dsRed-positieve, krullende vleugels en witte ogen. De gRNA-uitdrukkende vliegen werden als homozygote lijnen gehouden. Hun Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) fly stock nummers zijn: #84118 (Ubiq-CasRx), #84119 (Ubiq-dCasRx), #84124 (gRNAw), #84122 (gRNAN), #84123 (gRNAy), #84986 (gRNAGFP). Vlieggenetica (figuur 1A) Verzamel 10 maagdelijke volwassen vrouwelijke vliegen uit de homozygote gRNA-lijn en verzamel 5 volwassen mannelijke vliegen uit de gebalanceerde heterozygote Ubiq-CasRx / CyO-lijn. Doe de verzamelde vrouwelijke en mannelijke vliegen, die de ouderlijke vliegen worden genoemd, in een flacon aangevuld met droog gistpoeder (figuur 1A). Herhaal de vorige stap 3 keer om 3 replicaties te genereren. Gebruik voor de controlegroep de Ubiq-dCasRx/CyO-lijn terwijl al het andere hetzelfde blijft.OPMERKING: Voor een gewone glazen injectieflacon met voedsel is 0,1 g droog gistpoeder voldoende. Het vliegvoerrecept van de BDSC wordt gebruikt. Breng de injectieflacons met de ouderlijke vliegen gedurende 48 uur achter bij 26 °C. Verwijder vervolgens alle ouderlijke vliegen uit elke injectieflacon. Houd de injectieflacons vervolgens ten minste 20 dagen op 26 °C. Observeer de flesjes elke dag om te zien of er nieuwe volwassen nakomelingen zijn voortgekomen uit poppen van de F1-generatie. Als dat zo is, verdoof ze dan met koolstofdioxide door een buis in te brengen die is aangesloten op een koolstofdioxidetank in de vliegenflacons en vervolgens de stroomschakelaar gedurende 10 seconden in te schakelen. Zodra de vliegen onbeweeglijk worden, leegt u ze uit de flacon op een fly-pad, dat ook is verbonden met de koolstofdioxidetank en koolstofdioxide stroomt continu door de vliegpad. Scoor het fenotype van de verdoofde vliegen en stel ze in beeld met behulp van een kleurencamera die is aangesloten op een fluorescerende stereomicroscoop. Tel het aantal nakomelingen met verschillende fenotypen. Gebruik beeldverwerkingssoftware voor beeldnabewerking en compilatie (Figuur 2A – 2D).OPMERKING: Op basis van mendeliaanse genetica worden twee soorten vliegen verwacht onder de nakomelingen voor elke kruising (figuur 1A). RNA-Seq (Figuur 2E – 2G)MonsterverzamelingOPMERKING: Kies een geschikte methode voor het verzamelen van monsters uit de 3 onderstaande voorbeelden; 3 replicaties voor elk afzonderlijk monstertype zijn vereist.Verzameling van monsters van vliegenkoppen voor volwassenen Verzamel 10 maagdelijke volwassen vrouwelijke vliegen uit de homozygote gRNA-lijn. Verzamel 5 volwassen mannetjesvliegen uit de uitgebalanceerde heterozygote Ubiq-CasRx/CyO lijn. Doe de verzamelde vrouwelijke en mannelijke vliegen, de ouderlijke vliegen, in een flacon aangevuld met droog gistpoeder. Herhaal de vorige stap 3 keer voor 3 herhalingen. Gebruik voor de controlegroep de Ubiq-dCasRx/CyO-lijn terwijl al het andere hetzelfde blijft. Breng de injectieflacons met de ouderlijke vliegen gedurende 48 uur achter bij 26 °C. Verwijder vervolgens alle ouderlijke vliegen uit elke injectieflacon. Houd de injectieflacons vervolgens op 26 °C totdat de nakomelingen uit poppen komen. Verzamel 10 volwassen vliegen van 1 dag oud met het juiste fenotype. Verdoof de vliegen met koolstofdioxide, snijd vervolgens de vliegenkop af en plaats de koppen in een centrifugebuis van 1,5 ml op droogijs. Bewaar de centrifugebuis bij -80 °C. Herhaal deze stap 3 keer voor 3 herhalingen. 17 – 20 uur oude embryomonsterverzameling Verzamel 8-10 maagdelijke volwassen vrouwelijke vliegen uit de homozygote gRNA-lijn. Verzamel 4-5 volwassen mannelijke vliegen uit de uitgebalanceerde heterozygote Ubiq-CasRx / CyO-lijn. Doe de verzamelde vrouwelijke en mannelijke vliegen, de ouderlijke vliegen, in een flacon aangevuld met droog gistpoeder. Herhaal de vorige stap 3 keer voor 3 herhalingen. Gebruik voor de controlegroep de Ubiq-dCasRx/CyO-lijn terwijl al het andere hetzelfde blijft. Breng de injectieflacons met de ouderlijke vliegen gedurende 48 uur achter bij 26 °C. Bereid een druivensap embryo verzamelkamer voor elke replica volgens dit recept: 376 ml water, 126 ml druivensap, 15 g agar en 6 g sucrose. Doe de media in een bekerglas van 1 liter en zet het 5-6 minuten in de magnetron terwijl je de media in het bekerglas goed in de gaten houdt om te controleren of er bubbels / schuim verschijnen. Als dat zo is, stop dan de magnetron en laat de bubbel / schuim bezinken. Ga op deze manier door met microwaving totdat de bubbel helder wordt. Draai niet totdat alle bubbels helder zijn. Voeg ten slotte 10 ml 100% alcohol en 5 ml azijnzuur toe. Meng goed en pipetteer de media vervolgens in petrischalen van 35 mm met een serologische pipet van 25 ml. Wanneer media stollen in de petrischaal, is het klaar voor gebruik. Aan het einde van de incubatie van 48 uur brengen de ouderlijke vliegen over naar de druivensapembryokamers en bebroed ze bij 26 °C gedurende 3 uur. Verwijder vervolgens de volwassen vliegen terwijl je de vers gelegde embryo’s nog 17 uur op de druivensapplaten bij 26 °C bewaart. Verzamel na incubatie de 50 – 100 embryo’s van de druivensapplaten, reinig het embryooppervlak door ze onder te dompelen in gedeïoniseerd water en breng ze vervolgens over naar een centrifugebuis van 1,5 ml op ijs. Bewaar ze bij -80 °C. Herhaal deze stap 3 keer voor 3 herhalingen. Eerste instar larvae monsterverzameling Verzamel 8-10 maagdelijke volwassen vrouwelijke vliegen uit de homozygote gRNA-lijn. Verzamel 4-5 volwassen mannelijke vliegen uit de uitgebalanceerde heterozygote Ubiq-CasRx / CyO-lijn. Doe de verzamelde vrouwelijke en mannelijke vliegen, de ouderlijke vliegen, in een flacon aangevuld met droog gistpoeder. Herhaal deze stap 3 keer voor 3 herhalingen. Gebruik voor de controlegroep de Ubiq-dCasRx/CyO-lijn terwijl al het andere hetzelfde blijft. Breng de injectieflacons met de ouderlijke vliegen gedurende 48 uur achter bij 26 °C. Breng vervolgens de volwassen vliegen over naar een andere nieuwe normale voedselflacon voor incubatie ‘s nachts (16 uur) bij 26 °C. Verwijder vervolgens de volwassen vliegen. Houd de embryobevattende injectieflacon gedurende 24 uur op 26 °C en scoor vervolgens de transheterozygote eerste instarlarven onder de microscoop met behulp van verschillende markers. Verzamel 15-30 larven met de juiste fenotypen en doe ze in een centrifugebuis van 1,5 ml en bewaar ze bij -80 °C. Herhaal deze stap 3 keer voor 3 herhalingen. Sequencing RNA-extractie: gebruik een in de handel verkrijgbare RNA-extractiekit en volg de instructies van de kit om alle monsters te verwerken. Incubeer vervolgens de geëxtraheerde RNA-monsters met in de handel verkrijgbare deoxyribonuclease en volg de instructies om besmettend DNA uit de monsters te verwijderen. Meet de RNA-concentratie met behulp van een in de handel verkrijgbare UV-vis spectrofotometer. Meet de RNA-integriteit in de monsters met behulp van commercieel beschikbare RNA-integriteitstestopstellingen. Bouw de RNA-seq-bibliotheken met behulp van in de handel verkrijgbare RNA-bibliotheekvoorbereidingskit. Gebruik de externe sequencingservice voor bibliotheekvolgorde met de volgende instellingen: single read mode; leeslengte: 50nt, diepte: 20 miljoen keer gelezen per bibliotheek. Voer basisaanroepen uit met RTA 1.18.64 en converteer vervolgens de gegevens naar FASTQ met bcl2fastq 1.8.4.OPMERKING: Ruwe sequencinggegevens zijn te vinden in het National Center for Biotechnology Information Sequencing Read Archive (indienings-ID: SUB6818910 [BioProject: PRJNA600654]). Bioinformatica Map leest van de sequencinggegevens naar Release 6 Drosophila melanogaster-genoom van het Berkeley Drosophila Genome Project (GenBank-toetredingsnummer: GCA_000001215.4) en de exogene CasRx – en GFP-sequenties met behulp van de standaardparameterinstelling van STAR aligner28 met de toevoeging van de filteroptie “-outFilterType BySJout” en “-sjdbGTFfile Drosophila_melanogaster. BDGP6.22.97.gtf” genoverdracht formaat bestand van ENSEMBL. Bepaal het aantal onbewerkte transcripten voor elk geannoteerd transcript met de functie Counts35 met behulp van de opties “-t exon -g gene_id -M -O –fraction”. Normaliseer vervolgens het aantal onbewerkte transcripten met behulp van het totale aantal transcripten met behulp van het Perl-script “addTpmFpkmToFeatureCounts.pl”. Gebruik de maximale posteriori-methode met de oorspronkelijke krimpschatter in de DESeq2-pijplijn om de logaritmische vouwverandering (LFC) van elk gen te schatten. 2. Alomtegenwoordige in vivo exogene RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem Genereren van exogene doel alomtegenwoordige expressievector PCR versterkt het Ubiq promotor fragment met behulp van primers 1052B. C1 en 1052B. C2 en het Addgene plasmide #112686 26. Vervolgens versterkt PCR het T2A-eGFP-fragment versterkt uit Addgene plasmide #112686 met primers 908A.1 en 908A.2 (Tabel 1)26. Vervolgens versterkt PCR het Ubiq-promotorfragment als omgekeerde sequentie met addgene plasmide #112686 met primers 908A.3 en 908A.4 (tabel 1)26. Gelzuiver het Ubiq-promotorfragment, het T2A-eGFP-fragment en het omgekeerde Ubiq-promotorfragment met behulp van een gelzuiveringskit. Bestel een aangepaste firefly luciferase codeervolgorde en een aangepast fragment met een p10 3’UTR fragment, omgekeerde renilla luciferase gevolgd door een SV40 3’UTR fragment. Digest Addgene plasmide #112688 met restrictie-enzym AscI en XbaI24. In de resulterende producten zuivert gel de grotere fragmenten met behulp van een gelzuiveringskit, die de basisvectorruggegraat wordt genoemd. Gebruik de Gibson-assemblagemethode om de basisvector samen te stellen met de basisvectorbackbone en de volgende fragmenten: Ubiq-promotorfragment, het T2A-eGFP-fragment, het omgekeerde Ubiq-promotorfragment, de firefly luciferase-coderingssequentie en het omgekeerde renilla luciferase gevolgd door een SV40 3’UTR-fragment25.OPMERKING: De Addgene ID van de resulterende dual-luciferase expressievector (OA-1052B) is #132426. GRNA-expressievector genereren PCR versterkt de U6:3 promotorsequentie met behulp van primers 1043.C1 en 1043.C23 en de Addgene plasmide #112688 (Tabel 1)26. Gelzuiver de versterkte U6:3-fragmenten met behulp van een gelzuiveringskit. Digest Addgene plasmide #112688 met restrictie-enzym AscI en XbaI24. In de resulterende producten zuiveren gel de grotere fragmenten, die de pre-base vector backbone wordt genoemd, met behulp van gelzuiveringskit. Monteer de basisvector met de pre-base vector backbone en het U6:3 fragment met behulp van de Gibson assemblagemethode25. De basisvector hierna heet OA-1043. Synthetiseer het gRNA-fragment van het doelgen met behulp van externe gensynthesediensten. Verteer de basisvector OA-1043 met restrictie-enzym PstI en NotI24. Bewaar het gehele verteringsproduct, dat digested OA-1043 wordt genoemd. Assembleer gRNA-expressievector met het verteerde OA-1043 en doelgengRNA-fragment met behulp van de Gibson-assemblagemethode25.OPMERKING: De Addgene ID van het resulterende plasmide (OA-1052K) is #132422. Transgene vliegen genereren Injecteer OA-1052B vector in vliegenembryo’s met behulp van embryo’s van vliegen die ØC31-integratieplaats bevatten op het 3e chromosoom, BDSC-vliegvoorraadnummer 9744, via externe vliegenembryo-injectieservice. Injecteer op dezelfde manier OA-1052K-vector in vliegenembryo’s met behulp van embryo’s van vliegen die ØC31-integratieplaats bevatten op het 3e chromosoom, BDSC-vliegvoorraadnummer 8622. Kweek de geïnjecteerde embryo’s bij 26 °C. Houd de dual-luciferase-uitdrukkende vliegen en de gRNA vliegt als homozygote lijnen; houd de Ubiq-CasRx-lijnen als dubbel gebalanceerde heterozygote lijnen door de enkel gebalanceerde heterozygote Ubiq-CasRx-lijn gegenereerd in sectie 1 te kruisen naar balancerlijnen die TM6-balancerchromosoom dragen met stoppelmarker (Stb) marker en behoud alleen de dubbel uitgebalanceerde nakomelingen met witogige, gekrulde vleugels en dsRed-fluorescerende fenotypen tegelijkertijd.OPMERKING: De BDSC fly stock nummers zijn: #84127 (Ubiq-Fluc-Rluc), #84125 (gRNAFluc). Vlieggenetica (figuur 1B en figuur 3A) Verzamel 8-10 maagdelijke volwassen vrouwelijke vliegen uit de dual-luciferase-expressing lijn. Verzamel 4-5 volwassen mannelijke vliegen van de uitgebalanceerde heterozygote Ubiq-CasRx / CyO; +/TM6, Stb-lijn die tegelijkertijd witogige, gekrulde vleugels en dsRed-fluorescentie laten zien. Doe de verzamelde vrouwelijke en mannelijke vliegen, de ouderlijke vliegen, in een injectieflacon aangevuld met droog gistpoeder (hierna Stap 1 Kruis genoemd). Herhaal de vorige stap 3 keer voor 3 herhalingen. Gebruik voor de controlegroep de Ubiq-dCasRx/CyO; +/TM6, Stb lijn met behoud van al het andere hetzelfde. Breng de Step 1 Cross-injectieflacons met de ouderlijke vliegen gedurende 48 uur achter bij 26 °C. Verwijder vervolgens alle ouderlijke vliegen uit elke injectieflacon. Houd de injectieflacons vervolgens ten minste 14 dagen op 26 °C. Verzamel gedurende deze tijd 8-10 vrouwelijke maagden uit de homozygote vuurvlieg luciferase-targeting gRNA-lijn. Herhaal deze stap 3 keer voor 3 herhalingen. Observeer elke dag de Step 1 Cross-injectieflacons om te zien of er een nieuwe volwassen vlieg uit poppen komt. Als dat zo is, verdoof ze dan met koolstofdioxide, verzamel 5 mannelijke vliegen die zowel de Ubiq-CasRx (of Ubiq-dCasRx) als de dual-luciferase-reporter van de nakomelingen tot expressie brengen en stop ze in een nieuwe flacon samen met 10 maagdelijke vrouwtjes uit de vuurvlieg luciferase-gerichte gRNA-lijn (hierna Stap 2 Cross genoemd). Herhaal deze stap 3 keer voor 3 herhalingen. Verzamel nog eens 5 eendagsvliegjes die zowel de Ubiq-CasRx (of Ubiq-dCasRx) als de dual-luciferase reporter uit de Step 1 Cross-flacons tot expressie brengen en incubeer ze gedurende 2 – 4 dagen bij 26 °C. Breng ze vervolgens over in een centrifugebuis van 1,5 ml en bewaar ze bij -80 °C. Herhaal deze stap 3 keer voor drie herhalingen. Breng de Step 2 Cross-injectieflacons met de ouderlijke vliegen gedurende 48 uur achter bij 26 °C. Verwijder vervolgens alle ouderlijke vliegen uit elke injectieflacon. Houd de injectieflacons vervolgens ten minste 20 dagen op 26 °C. Observeer elke dag de stap 2 kruisflacons om te zien of er nieuwe volwassen nakomelingen uit poppen zijn voortgekomen. Als dat zo is, verdoof ze dan met koolstofdioxide, scoor de fenotypen van de verdoofde vliegen en stel ze in beeld met een kleurencamera uitgerust met een fluorescerende stereomicroscoop. Tel het aantal nakomelingen met verschillende fenotypen. Gebruik beeldverwerkingssoftware voor beeldnabewerking en compilatie (Figuur 3B – 3C).OPMERKING: Mendeliaanse genetica suggereert dat, als vliegen allemaal levensvatbaar zijn, 4 soorten vliegen worden verwacht onder de nakomelingen van Stap 2 Kruis, elk goed voor 25% van de populatie (figuur 1B en figuur 3A). Luciferase assay (Figuur 3D) Genereer zowel de drievoudige transheterozygote vliegen als de controlevliegen door stap 2.4.1-2.4.5 te herhalen. Verzamel mannelijke vliegen bij de geboorte en laat ze rijpen tot 3 dagen oud. Breng de 3 dagen oude vliegen over in 1,5 ml centrifugebuizen en lyseer ze met behulp van een stamper en de luciferaselysisbuffer van de in de handel verkrijgbare luciferase-testkit. Gebruik 5 μL gelyseerd weefsel van elk monster om zowel de firefly- als renilla luciferase-activiteit te meten met behulp van in de handel verkrijgbare luciferase-assaykit en luminometer. 3. Weefselspecifieke in vivo RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem Genereren van UASt-CasRx en UASt-dCasRx Expression Vector PCR versterkt de UASt-promotorsequentie met behulp van plasmide pJFRC81 en primers 1041.C9 en 1041.C11; vervolgens versterkt PCR CasRx-fragment met plasmide OA-1050E (Addgene ID #132416) en primers 1050L. C1 en 1050E. C4; en vervolgens PCR versterken dCasRx-fragmenten met plasmide OA-1050R (Addgene ID #132417) en primers 1050L. C1 en 1050E. C4 (tabel 1)26. Gelzuiver de versterkte UASt-promotorsequentie, CasRx en dCasRx-fragmenten met behulp van een gelzuiveringskit. Verteer base vector (Addgene plasmid #112686) met restrictie-enzymen NotI en PacI24. In de resulterende producten zuivert gel het grotere fragment, dat de basisvectorruggegraat wordt genoemd, met behulp van gelzuiveringskit. Monteer de UASt-CasRx-vector met de basisvectorbackbone, de UASt-promotorsequentie en het CasRx-fragment met behulp van de Gibson-assemblage; assembleer vervolgens de UASt-dCasRx-vector met de basisvectorbackbone, de UASt-promotorsequentie en het dCasRx-fragment met behulp van de Gibson-assemblagemethode25.OPMERKING: De UASt-CasRx-vector is Addgene plasmide #132418 en de UASt-dCasRx vector is Addgene plasmide #132419 Transgene vliegen genereren Injecteer UASt-CasRx vector in vliegenembryo’s met behulp van vliegenembryo-injectieservice en embryo’s van vliegen ØC31 integratieplaats 8621 op hun 2e chromosomen; injecteer vervolgens UASt-dCasRx vector in vliegenembryo’s met behulp van vliegenembryo-injectieservice en embryo’s van vliegen ØC31 integratieplaats 8621 op hun 2e chromosomen. Kweek de geïnjecteerde embryo’s bij 26 °C. Houd de vliegen als dubbel gebalanceerde heterozygote lijnen met CyO- en Sb-markers. OPMERKING: De ID’s van de vlieglijnen in BDSC zijn 84121 (UASt-CasRx) en 84120 (UASt-dCasRx). Vlieggenetica (figuur 1C) Bestel gewenste GAL4 lijnen bij BDSC; Verkrijg relevante gRNA-lijnen uit stap 3.2.2 (of uit BDSC).OPMERKING: De volgende 2 GAL4 vliegen van BDSC werden gebruikt: GAL4-GMR (BDSC ID: #29967), GAL4-y (BDSC ID: #44373). Dezelfde 3 gRNA-lijnen gegenereerd in de eerste sectie werden gebruikt: gRNAw (BDSC ID: #84124), gRNAN (BDSC ID #84122), gRNAy (BDSC ID: #84123). Verzamel 5-10 maagdelijke volwassen vrouwelijke vliegen uit de gRNA-lijn. Verzamel 2-4 volwassen mannelijke vliegen van de dubbel gebalanceerde heterozygote UASt-CasRx / CyO; +/TM6, Sb-lijn die tegelijkertijd witogige, gekrulde vleugels en dsRed-fluorescentie laten zien. Doe de verzamelde vrouwelijke en mannelijke vliegen, de ouderlijke vliegen, in een gewone voedselflacon (hierna stap 1 kruis genoemd). Herhaal deze stap 3 keer voor 3 herhalingen. Gebruik voor de controlegroep de UASt-dCasRx/CyO; +/TM6, Sb lijn met behoud van al het andere hetzelfde. Breng de Step 1 Cross-injectieflacons met de ouderlijke vliegen gedurende 48 uur achter bij 26 °C. Verwijder vervolgens alle ouderlijke vliegen uit elke injectieflacon. Houd de injectieflacons vervolgens ten minste 14 dagen op 26 °C. Verzamel gedurende deze tijd 5-10 vrouwelijke maagden uit de GAL4-lijn. Herhaal deze stap 3 keer voor 3 herhalingen. Observeer elke dag de Step 1 Cross-injectieflacons om te zien of er een nieuwe volwassen vlieg uit poppen komt. Als dat zo is, verdoof ze dan met koolstofdioxide, verzamel 2-4 mannelijke vliegen die zowel de UASt-CasRx (of UASt-dCasRx) als de gRNA-vector uit de nakomelingen tot expressie brengen die tegelijkertijd dsRed-fluorescerende en stoppelbephenotypen hebben. Doe de verzamelde mannetjes uit Stap 1 Kruis in een nieuwe flacon samen met 5-10 verzamelde maagdelijke vrouwtjes uit de GAL4-lijn (hierna Stap 2 Kruis genoemd). Herhaal deze stap 3 keer voor 3 herhalingen. Breng de Step 2 Cross-injectieflacons met de ouderlijke vliegen gedurende 48 uur achter bij 26 °C. Verwijder vervolgens alle ouderlijke vliegen uit elke injectieflacon. Houd de injectieflacons vervolgens ten minste 20 dagen op 26 °C. Observeer de Step 2 Cross-injectieflacons elke dag om te zien of er nieuwe volwassen vliegen uit poppen komen. Als dat zo is, verdoof ze dan met koolstofdioxide, scoor de fenotypen van de verdoofde vliegen en stel ze in beeld met een kleurencamera uitgerust met een fluorescerende stereomicroscoop. Tel het aantal nakomelingen met verschillende fenotypen. Gebruik beeldverwerkingssoftware voor beeldnabewerking en compilatie (figuur 4).OPMERKING: Mendeliaanse genetica suggereert dat, als vliegen allemaal levensvatbaar zijn, 4 soorten vliegen worden verwacht onder de nakomelingen van Stap 2 Kruis, elk goed voor 25% van de populatie (figuur 1C).

Representative Results

Alomtegenwoordige in vivo RNA-targeting met behulp van een tweecomponenten CasRx-systeemDe F1 transheterozygote vliegen die zowel de Ubiq-CasRx als het gRNA tot expressie brengen (gericht op zowel endogene als exogene genen) constructen vertoonden duidelijke fenotypes in vergelijking met de controlevliegen die de Ubiq-dCasRx- en gRNA-constructen tot expressie brachten (figuur 2 en figuur 4). In het bijzonder hebben de transheterozygote CasRx-vliegen een significant lagere overlevingskans in vergelijking met de transheterozgyous dCasRx-vliegen, wat wijst op toxiciteit van het Ubiq-CasRx-systeem (figuur 2A en figuur 4A). Het is vermeldenswaard dat zowel transheterozygote CasRx- als dCasRx-vliegen minder dan 50% overervingspercentage hebben, wat de verwachte verhouding is op basis van Mendeliaanse genetica. Van de drie doelgenen is de Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ vliegen en Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAy/+ vliegen zijn niet levensvatbaar (0% overerving) en groeiden niet verder dan het tweede stadium van de instarlarven (figuur 2A-2B). De overlevende Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAw/+ vliegen, waarvan de overerving 12,9% was, vertoonden een duidelijk volledig penetrant witogig fenotype (figuur 2B). Naast waarneembare eigenschappen geassocieerd met CasRx, konden we een significante vermindering van doelgenranscripten bevestigen voor 3 doelgenen: Notch, geel en GFP (figuur 2E-2G). Reductie van witte gentranscripten werd waargenomen bij Ubiq-CasRx/+, U6-gRNAw/+ vliegen, vergeleken met de controle Ubiq-dCasRx/+, U6-gRNAw/+ vliegen, hoewel de reductie niet statistisch significant was (Figuur 2E – 2F). Bewijs van off-target activiteit geïnduceerd door CasRx werd gevonden bij het vergelijken van de differentieel uitgedrukte transcripten tussen monsters van CasRx-tot expressie brengende vliegen en monsters van dCasRx-tot expressie brengende vliegen (Figuur 2E, 2G). Het aantal niet-doeltranscripten dat significant differentieel wordt uitgedrukt, is als volgt: wit, 253 (1,4% van de totale transcripties); Inkeping, 300 (1,7%); geel, 41 (0.23%); GFP, 5.880 (33%) (Figuur2G). Van de in totaal 17.779 verschillende transcripten werden 6 niet-doeltranscripten significant differentieel uitgedrukt in alle 4 groepen monsters. Een van de 6 geïdentificeerde transcripten was Gadd45, een gen dat betrokken is bij apoptose en cellulaire arrestatie bij vliegen, waardoor de mogelijkheid ontstaat dat de enzymatische werking van CasRx direct cellulaire apoptose kan veroorzaken of indirect verkeerde expressie van andere genen kan veroorzaken, wat op zijn beurt leidt tot apoptose. Ten slotte is het vermeldenswaard dat de Ubiq-CasRx- en Ubiq-dCasRx-vliegen niet werden vastgesteld als homozygote bestanden, vermoedelijk als gevolg van toxiciteit veroorzaakt door een hoge alomtegenwoordige expressie. Als gevolg hiervan werden heterozygote Ubiq-CasRx / CyO- en Ubiq-dCasRx / CyO-vliegen gebruikt voor kruising met homozygote gRNA-vlieglijnen. Kortom, het tweecomponenten Ubiq-CasRx-systeem is in staat om alomtegenwoordige RNA-targeting te bereiken voor zowel endogene als exogene doelen, wat resulteert in waarneembare fenotypen en transcriptreductie. Deze resultaten toonden ook aan dat CasRx-gemedieerde RNA-targeting in vivo toxiciteit kan introduceren. Alomtegenwoordige in vivo exogene RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeemDe resultaten van de tweestapskruising toonden aan dat ondanks de exogene aard van het doelgen (d.w.z. Fluc), het tot expressie brengen van alle drie de transgenen in F2 triple transheterozygoten (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) resulteerde in 100% letaliteit in vergelijking met controlekruisingen met Ubiq-dCasRx, waarbij geen letaliteit werd waargenomen in de F2 triple transheterozygoten (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) (Figuur 3B-C ). Meer specifiek resulteerde alleen de combinatie van alle drie de transgenen (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) in 100% letaliteit (figuur 3B en D), terwijl (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6) en (Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6) genotypen waren levensvatbaar en hadden geen fenotypes met hun overervingspercentages die overeenkwamen met de verwachte Mendeliaanse transmissiesnelheden, wat suggereert dat de beschikbaarheid van de doelsequentie (d.w.z. firefly luciferase) in combinatie met Ubiq-CasRx/+ en het gRNAFluc is wat resulteerde in de waargenomen letaliteit fenotypes, vermoedelijk afkomstig van de collaterale activiteit van Cas13 enzymen2,8 . Bovendien geen onderscheidbare fenotypen of dramatische invloed op overerving in F1-transheterozygoten (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ of Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) werden waargenomen in vergelijking met Ubiq-dCasRx-controles (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ of Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) (Figuur 3B), wat aangeeft dat een katalytisch actief enzym essentieel is om de waargenomen letaliteitsfenotypen te verkrijgen. Bovendien vertoonden fluc- en rluc-expressieniveaus bij vliegen van alle levensvatbare genotypen geen significante vermindering van fluc-expressie in de Ubiq-dCasRx drievoudige transheterozygoten (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) in vergelijking met dual luciferase reporter controls. Dit suggereert dat fluc-eiwitexpressieniveaus niet werden verlaagd door dCasRx-targeting (figuur 3D). Alles bij elkaar geven de gemeenschappelijke letaliteit fenotype in de twee verschillende CasRx-gemedieerde alomtegenwoordige RNA-targetingexperimenten aan dat casRx-gemedieerde RNA-targeting bij gebruik op weefsels alomtegenwoordig toxisch kan zijn voor het organisme. Weefselspecifieke in vivo RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeemHet hoge niveau van toxiciteit waargenomen in alomtegenwoordige RNA-targetingexperimenten heeft ons ertoe aangezet om de weefselspecifieke RNA-targeting te onderzoeken met behulp van een driecomponenten CasRx-systeemontwerp dat wordt beschreven in de sectie methoden. Inderdaad, het waargenomen toxiciteitsniveau werd verminderd wanneer de totale CasRx-expressie werd verlaagd met behulp van de UASt-promotor in vergelijking met die van de Ubiq-promotor, dit wordt geïllustreerd in drie aspecten: 1) de UASt-CasRx- en UASt-dCasRx-lijnen werden gehandhaafd als homozygote lijnen, hoewel op basis van het tweestapskruisschema dubbel gebalanceerde UASt-CasRx- en UASt-dCasRx-lijnen werden gebruikt om de kruisingen uit te voeren, 2) alle F2-generatie dCasRx triple transheterozygote overervingspercentages kwamen overeen met de verwachte 25% Mendeliaanse overervingsratio, en 3) de F2-generatie CasRx triple transheterozygote letaliteit fenotype was matig verminderd. In het white targeting experiment, van de 25% Mendeliaanse overervingspercentages verwacht in de F2 triple transheterozygoten, werd slechts 0,57% levensvatbare volwassen vliegen (UASt-CasRx/+; gRNAw/GMR-Gal4) waargenomen, die allemaal ernstige oogspecifieke pigmentatie en morfologie fenotypes vertoonden (figuur 4A en 4B). Voor het wit-gerichte kruis was de CasRx-expresserende drievoudige transheterozygote F2-overervingssnelheid significant lager dan die van de dCasRx-uitdrukkende drievoudige transheterozygote controlegroep (27,6%) (figuur 4A). In het Notch-targetingexperiment waren CasRx-tot expressie brengende drievoudige tranheterozygoten die alle drie de transgenen droegen 100% dodelijk, terwijl de dCasRx-controle-overerving 29,3% was (figuur 4A). In het gele targetingexperiment vertoonden F2 triple transheterozygote CasRx-expressing, gRNAy en y-GAL4 marginale chitinepigmentreductie als kleine vlekken van gele cuticula op de thorax en buik met een overervingspercentage van 2,67%, veel lager dan dat van de dCasRx-controlegroep (25,2%) (Figuur4A ). Alle dCasRx-controle drievoudige transheterozygote vliegen vertoonden geen duidelijke fenotypen als de CasRx-tot expressie brengende vliegen, wat aangeeft dat katalytische activiteit van CasRx bijdroeg aan de waargenomen fenotypen. De lage overervingssnelheid in de CasRx triple transheterozygote groep suggereerde dat er twee bronnen van toxiciteit bestaan in CasRx RNA-targeting: één is geassocieerd met een hoge expressie van CasRx, waarvan de toxiciteit werd verminderd door restrictieve CasRx-expressie, de andere is geassocieerd met de nevenactiviteit. Samen toonden deze resultaten aan dat het CasRx-systeem weefselspecifieke in vivo RNA-targeting kan bereiken door gebruik te maken van het klassieke Gal4 / UASt-systeem en in de tussentijd de toxiciteit te verminderen. Toxiciteit en incidentele letaliteitsfenotypen werden echter nog steeds waargenomen op een lager niveau van ernst in vergelijking met die van de alomtegenwoordige benaderingen, wat aangeeft dat collaterale splitsingsactiviteit geassocieerd is met toxiciteit. Figuur 1: Algemeen overzicht van RNA-targeting met behulp van een Cas13D-systeem. (A) Schema’s van de eenstaps genetische kruising in de alomtegenwoordige in vivo RNA-targeting met behulp van een tweecomponenten CasRx-systeem. (B) Schema’s van een genetische kruising in twee stappen in het alomtegenwoordige in vivo exogene RNA dat zich richt op het driecomponenten CasRx-systeem. (C) Schema’s van een tweestaps genetisch kruising in het weefselspecifieke in vivo RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Alomtegenwoordige in vivo RNA-targeting met behulp van een tweecomponenten CasRx-systeem (herdrukt5). (A) Totale overervingspercentages van transheterozygote vliegen die Ubiq-CasRx (of Ubiq-dCasRx) en gRNA’s erven. Blauwe arcering in de boxplot geeft fenotype penetrantie aan. (B) Fenotypen van transheterozygote vliegen. Pijlen duiden op weefselnecrose in het oog. Zwart-witte vlieg gemarkeerd met ”X” staat voor dodelijkheid. (C) Totale overervingspercentages van transheterozygote vliegen van bidirectionele kruisingen tussen Ubiq-CasRx (of Ubiq-dCasRx) en gRNAGFP-OpIE2-GFP-vliegen. M, maternale overerving van CasRx; P, vaderlijke erfenis van CasRx. (D) F1-larven nakomelingen in het vaderlijke kruis. (E) De maximale a posteriori schattingen van transcripties voor de logaritmische vouwverandering. De DESeq2-pijplijn werd gebruikt. (F) Transcripties per miljoen (TPM) gericht met CasRx of dCasRx. (G) CasRx-depentent differentieel uitgedrukt transcriptpercentage van transcripten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Alomtegenwoordige in vivo exogene RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem. (A) Schema’s van het tweestaps genetisch kruis. (B) Totale overervingspercentages voor alle genotypen die in de F2-generatie ontstaan . Het erven van alle drie de transgenen (Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc en gRNAFLuc) in F2-nakomelingen resulteerde in 100% letaliteit en was significant lager in vergelijking met de Ubiq-dCasRx triple transheterozygotes controlegroep (p = 0,001, t-test). (C) Het dragen van Ubiq-CasRx/gRNAFluc alleen of Ubiq-CasRx en Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc alleen leidde niet tot ernstige letaliteit, en de overervingsverhoudingen tussen Ubiq-CasRx en Ubiq-dCasRx transheterozygoten waren niet significant verschillend (p = 0,41 en p = 0,51, respectievelijk, t-test). (D) Luciferase-verhoudingen normaliseren Fluc-metingen tot Rluc-metingen. Drievoudige transheterozygote vliegen die Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc, gRNAFLuc tot expressie brachten, waren embryonaal dodelijk, die werd vertegenwoordigd door een vlieg met een “X”, en als gevolg daarvan werd luciferase-expressie niet gemeten. Fluc/Rluc ratio van Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb transheterozygoten was significant lager dan die van de andere Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc-expresserende groepen (p = 1,2e-06 of lager, t-test). De resultaten van de gRNAFLuc-only groep waren significant lager dan die van alle andere groepen (p = 1,2e-06 of lager, t-test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Weefselspecifieke in vivo RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem (herdrukt5). (A) Totaal overervingspercentage van drievoudige transheterozygote vliegen die drie transgenen dragen (UASt-CasRx of UASt-dCasRx, gRNA’s en Gal4-driver. (B) Fenotypen van de drievoudige transheterozygote vliegen. De witte pijl duidt op chitine pigmentreductie in de thorax. Zwart-witte vlieg gemarkeerd met ”X” staat voor dodelijkheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Bouwen Beschrijving Abc Primer-reeks (5′ tot 3′) PCR-sjabloon OA-1050E Casrx 1050E. C3 TACTAATTTTCCACATCTCTATTTTGACCCGCAGATTAATTAATGAGCCCCAAGAAGAA pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx) 1050E. C4 CAATTGATTTGTTATTTTAAAAACGATTCATTCTAGCTAGCTTAAGCGTAATCTGGAACA OA-1050r dCasRx 1050E. C3 TACTAATTTTCCACATCTCTATTTTGACCCGCAGATTAATTAATGAGCCCCAAGAAGAA pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx) 1050E. C4 CAATTGATTTGTTATTTTAAAAACGATTCATTCTAGCTAGCTTAAGCGTAATCTGGaaca Artrose-1050l UASt promotor 1041,C9 GCGGGTTCTCGACGGTCACGGCGGGCATGTCGACGCGGCCGCAACCAACAACACTAGTAG PJFRC81 1041,C11 CTGGCCTCCACCTTTCTCTTCTTCTTGGGGCTCATGTTTAAACCCAATTCCCTATTCAGA Casrx 1050l. C1 AATACAAGAAGAGAACTCTGAATAGGGAATTGGGTTTAAACATGAGCCCCAAGAAGAA pCasRx 1050E. C4 CAATTGATTTGTTATTTTAAAAACGATTCATTCTAGCTAGCTTAAGCGTAATCTGGAACA OA-1050s UASt promotor 1041,C9 GCGGGTTCTCGacggtcacgGCGGGCATGTCGACGCGGCCGCAACCAACAACACTAGTAG PJFRC81 1041,C11 CTGGCCTCCACCTTTCTCTTCTTCTTGGGGCTCATGTTTAAACCCAATTCCCTATTCAGA dCasRx 1050l. C1 AATACAAGAAGAGAACTCTGAATAGGGAATTGGGTTTAAACATGAGCCCCAAGAAGAA PDCasRx 1050E. C4 CAATTGATTTGTTATTTTAAAAACGATTCATTCTAGCTAGCTTAAGCGTAATCTGGAACA Artrose-1043 U6:3 promotor 1043,C1 GGGAATTGGGAATTGGGCAATATTTAAATGGCGGCGCGCCGAATTCTTTTTTGCTCACCT Addgene plasmide #164586 1043,C23 ACACTAGTGGATCtctagaggtacCGTTGCGGCCGCAAAAAAGTTGTAATAGCCCCTCAAAACTGGACCTTCCACAACTGCAGCCGACGTTAAATTGAAA OA-1052b Ubiq promotor 1052b. C1 GGGAATTGGGCAATATTTAAATGGCGGCTGCAGCGCAGATCGCCGAT Addgene plasmide #112686 1052b. C2 TTTCTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCATCCTAGGTCTGCGGGTCAAAATAGagatg T2A-eGFP 908A1 ATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGC Addgene plasmide #112686 908a2 TTGTTATTTTAAAAACGATTCATTCTAGGCGATCGCTTACTTGTACAGCTCGtccatgcc Omgekeerde Ubiq promotor 908A3 ACCGTGACCTACATCGTCGACACTAGTGGATCTCTAGACGCGCAGATCGCCGATG Addgene plasmide #112686 908a4 GGATCATAAACTTTCGAAGTCATGCGGCCGCTCTGCGGGTCAAAATAGAGAtgt Tabel 1: Lijst van moleculaire constructen en primers die in deze studie zijn gebruikt. Deze lijst bevat alle constructen (zowel de ID als de beschrijving) en de bijbehorende primers van elk construct (zowel de ID als de sequenties (5′ tot 3′)) en gebruikte sjablonen.

Discussion

Met drie verschillende toepassingsontwerpen van het CasRx-systeem demonstreerde dit werk in vivoprogrammeerbare RNA-targeting in vliegen. De verschillende strategieën komen tegemoet aan verschillende projectbehoeften, zoals endogene versus exogene gentargeting en alomtegenwoordige versus weefselspecifieke RNA-targeting. De effecten van RNA-targeting omvatten doelgenspecifieke fenotypische veranderingen, doel-RNA-transcriptreductie en incidentele letaliteitsfenotypen geassocieerd met hoge expressie van CasRx-eiwit en collaterale activiteit. Over het algemeen toonden deze resultaten aan dat het CasRx-systeem in staat is om op een programmeerbare en efficiënte manier RNA-transcriptreductie op organismeniveau te targeten.

Een van de belangrijkste factoren bij het succesvol aanpassen van het CasRx-systeem is het ontwerp van gRNA’s. In het bijzonder moet het volgende advies in acht worden genomen: de doelsequentie is ongeveer 30 nucleotiden lang, de lengte van poly-U-rekken in de doelsequentie is 4 basenparen of minder, het doelsequentie GC-gehalte ligt in het bereik van 30% – 70%, de doelsequentie zal naar verwachting geen sterke RNA-haarspeldstructuren vormen en de doelsequentie bevat een minimale voorspelde secundaire of tertiaire structuur van RNA5.

Naast de gRNA-ontwerpen is de vlieggeneticastap in elk protocol ook van cruciaal belang voor een succesvolle implementatie. De aanwezigheid of het ontbreken van de gedefinieerde fenotypen die van de ouders in de nakomelingen zijn doorgegeven, zijn belangrijk voor het identificeren en kwantificeren van fenotypen geïnduceerd door het CasRx-systeem in de transheterozygote nakomelingen. Ook het parallel opzetten van controlekruisen met behulp van de dCasRx-vliegen is ook nuttig bij het uitsluiten van niet-specifieke fenotypen in de transheterozygote nakomelingen.

Het is vermeldenswaard dat deze resultaten toxiciteitsprobleem onthulden dat werd geïntroduceerd door alomtegenwoordig CasRx- en dCasRx-eiwit in de vlieg tot expressie te brengen, een beperking van het CasRx-systeem. Alomtegenwoordige expressie van CasRx of dCasRx onder de Ubiq-promotor alleen, zonder gRNA’s, kwam met niet-triviale fitnesskosten, omdat noch Ubiq-CasRx noch Ubiq-dCasRx-vliegen konden worden vastgesteld als homozygote lijnen. Integendeel, UASt-CasRx- en UASt-dCasRx-vliegen kunnen worden vastgesteld als gezonde homozygote bestanden, hoewel ze vanwege het ontwerp van het kruisschema werden gehouden als dubbel uitgebalanceerde bestanden, een feit dat het bestaan van toxiciteit ondersteunt die wordt geïnduceerd door alomtegenwoordige CasRx-eiwitexpressie. Een ander bewijsstuk is dat in controle-experimenten met dCasRx, dat katalytisch inactief is, de percentages vliegen die zowel dCasRx- als gRNA-constructies dragen van het totale aantal vliegen in de F1-generatie consistent lager waren dan 50%, de verhouding die werd verwacht op basis van Mendeliaanse genetica als er geen dCasRx-geassocieerde toxiciteit aanwezig was. Dit gaf aan dat het alomtegenwoordig tot expressie brengen van dCasRx, samen met gRNA’s, toxiciteit in de vlieg induceert, wat resulteert in een minder dan verwachte overervingsverhouding. De overervingsverhoudingen van transheterozygote UASt-dCasRx, gRNA, GAL4-vliegen volgden de Mendeliaanse genetica, wat opnieuw de toxiciteit suggereert die specifiek wordt geïnduceerd door alomtegenwoordige expressie van CasRx- en dCasRx-eiwitten. Toxiciteit in CRISPR/Cas-systeem is niet nieuw. Van grote hoeveelheden Cas9-eiwit is aangetoond dat ze giftig zijn in verschillende organismen, waaronder vliegen29,30,31,32. Een recente studie heeft een aangepast GAL4 / UAS-systeem ontwikkeld dat de hoeveelheid Cas9-eiwit uitgedrukt in vliegen kan afstemmen door een open leesframe van verschillende lengte toe te voegen tussen de UAS-sequentie en de Cas9-sequentie in de UAS-Cas9-construct33. Daarom is het de moeite waard om manieren te onderzoeken om casrx-geïnduceerde toxiciteit te verminderen door het casrx-eiwitexpressieniveau af te stemmen.

Afgezien van de toxiciteit geïnduceerd door alomtegenwoordige expressie van CasRx- en dCasRx-eiwitten, toonden de resultaten ook dodelijkheid gekoppeld aan de niet-specifieke collaterale off-target effecten van het CasRx-systeem, een kenmerk van veel CRISPR-systemen1,2,7,34. In sommige van de CasRx en niet-essentiële gen gRNA-tot expressie brengende dubbele of drievoudige transheterozygote vliegen, bijvoorbeeld bij het richten op Notch, hebben de transheterozygote CasRx-vliegen aanzienlijk lagere overlevingskansen in vergelijking met de transheterozgyous dCasRx-vliegen. In de RNA-seq-analyse van deze CasRx- en gRNA-tot expressie brengende transheterozygote vliegen werden zowel de verlaging van de transcriptieniveaus van het doelgen als de vermindering van niet-doelgentranscripten waargenomen. Deze neveneffecten waren CasRx-afhankelijk en doelafhankelijk, omdat ze alleen werden waargenomen bij transheterozygote vliegen die zowel het CasRx-eiwit als het gRNA tot expressie brachten. Het is de moeite waard erop te wijzen dat een van de doelgenen, wit, slechts een beperkte, niet-statistisch significante vermindering van transcripten vertoonde wanneer het witte gen werd aangevallen door CasRx, wat in tegenstelling was tot het duidelijke pigmentreductiefenotype. Er wordt verondersteld dat dit te wijten kan zijn aan het feit dat 1) de timing van de RNA-seq-monsterverzameling niet goed was afgestemd op de timing wanneer het witte gen zijn piekexpressie bereikte tijdens de vroege ontwikkeling, en 2) de gelokaliseerde expressie van het witte gen in de ogen het een uitdaging maakt om de relevante weefsels te verzamelen tijdens de vroege ontwikkelingsfase wanneer alleen het verzamelen van monsters van het hele lichaam haalbaar is. Om de nevenactiviteit in het CasRx-systeem te verminderen, zijn toekomstige studies nodig om de mechanismen die ten grondslag liggen aan het off-target fenomeensysteem op organismaal niveau volledig te begrijpen.

Interessant is dat een recente studie35 die RNA-targeting Cas13-tools bij vliegen beschreef, om verschillende mogelijke redenen de algemene toxiciteit geassocieerd met CasRx-expressie leek te verbeteren. Ten eerste hercodeerden de auteurs de Cas13-transgenen om de expressie in Drosophila te optimaliseren en gebruikten ze een zwakker tot expressie brengende promotor (actine 5C) in vergelijking met de ubiquitinepromotor die in de huidige studie werd gebruikt, wat waarschijnlijk leidde tot lagere niveaus van Cas13-expressie en dus minder toxiciteit. Dit wordt inderdaad ondersteund door de observaties dat UASt-gedreven CasRx- en dCasRx-expressie op zichzelf niet giftig was, omdat deze studie (en de auteurs in 35) geen duidelijke dodelijkheid in UASt-CasRx-vliegen waarnam. Bovendien codeerden deze auteurs hun gRNA’s anders in vergelijking met deze studie, wat hun expressie kan hebben beïnvloed en de toxiciteit van het systeem in transheterozygote Cas13 / gRNA-vliegen kan hebben verminderd. In hun studie werden bijvoorbeeld twee gRNA’s tot expressie gebracht met behulp van de U6: 3-promotor en geflankeerd door tRNA-verwerking bij tRNA-rijping zonder CasRx35. Omgekeerd werden in deze studie de gRNA’s gecodeerd als arrays gericht op maximaal 4 locaties per gen en het nabootsen van de endogene Cas13-arraystructuur in bacteriën, waarvoor het Cas13-enzym nodig is om elk gRNA te verwerken. Deze verschillende benaderingen kunnen hebben geleid tot verschillen in gRNA-expressieniveaus en andere factoren die inherente effecten kunnen hebben op de toxiciteit van het hele systeem. Ten slotte richtten Huynh et al. zich op andere genen dan die waarop de huidige studie was gericht, die resulteren in verschillen in target-Cas / gRNA-interactie en collaterale activiteit en effecten kunnen hebben op de waargenomen niveaus van letaliteit. Deze verschillen in waargenomen toxiciteit rechtvaardigen verder onderzoek om manieren te vinden waarop de algehele systemen kunnen worden verbeterd.

Over het algemeen is deze studie de eerste demonstratie van een functioneel genetisch gecodeerd programmeerbaar RNA-targeting Cas-systeem in D. melanogaster, hoewel verdere optimalisatie van het CasRx-systeem (in overeenstemming met wat wordt gemeld35) nodig zal zijn om de off-target-geassocieerde letaliteit verder te verminderen en de werkzaamheid van CasRx on-target splitsing te verhogen. RNA-targeting met Cas-enzymen is een snel evoluerend veld met veel potentiële toepassingen, variërend van insectenvectorcontrole tot therapeutisch gebruik1,2,3,4,5,6,7, en dit protocol biedt een startpakket voor iedereen die geïnteresseerd is in het ontwerpen van hun eerste CasRx-systeem in vliegen, terwijl het compatibel is met maatwerk en verdere optimalisatie van het systeem. De hier gepresenteerde voorbeelden tonen een reeks resultaten die men kan tegenkomen tijdens de implementatie van dit systeem in vivo en kunnen dienen als benchmarks voor andere gebruikers bij het evalueren van de prestaties van het CasRx-systeem in hun toepassingen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van een DARPA Safe Genes Program Grant (HR0011-17-2-0047) en NIH-awards (R21RAI149161A, DP2AI152071) toegekend aan O.S.A.

Materials

100% Grape Juice Welch Foods Inc. N/A
Active Dry Yeast (908g) Red Star Yeast Company, LLC N/A
DMC4500 color camera Leica Microsystems DMC4500
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
GAL4-GMR flies Bloomington Drosophila Stock Center 29967
GAL4-y flies Bloomington Drosophila Stock Center 44373
Glomax 20/20 Luminometer Promega E5331
Illumina HiSeq2500 Sequencer Illumina, Inc. HiSeq2500
M165FC fluorescent stereomicroscope Leica Microsystems M165FC
Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer ThermoFisher NDONEC-W
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit New England Biolabs, Inc. E7770
plasmid # 112686 Addgene 112686
plasmid # 112688 Addgene 112688
plasmid # 132416 Addgene 132416
plasmid # 132417 Addgene 132417
plasmid # 132419 Addgene 132419
plasmid # 132420 Addgene 132420
plasmid # 132421 Addgene 132421
plasmid # 132422 Addgene 132422
plasmid # 132425 Addgene 132425
plasmid # 132426 Addgene 132426
plasmid # 133304 Addgene 133304
plasmid # 164586 Addgene 164586
plasmid #132418 Addgene 132418
plasmid pJFRC81 Addgene 36432
Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Restriction endonucleases AscI New England Biolabs Inc. R0558L
Restriction endonucleases NotI New England Biolabs Inc. R0189L
Restriction endonucleases PacI New England Biolabs Inc. R0547L
Restriction endonucleases PstI New England Biolabs Inc. R0140L
Restriction endonucleases SwaI New England Biolabs Inc. R0604L
Restriction endonucleases XbaI New England Biolabs Inc. R0145L
RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer Agilent Technologies 5067-1513
Turbo DNase Invitrogen AM2238
U6-3:4-gRNA-Fluc flies Bloomington Drosophila Stock Center 84125
U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies Bloomington Drosophila Stock Center 84986
U6-3:4-gRNA-N flies Bloomington Drosophila Stock Center 84122
U6-3:4-gRNA-w flies Bloomington Drosophila Stock Center 84124
U6-3:4-gRNA-y flies Bloomington Drosophila Stock Center 84123
UASt-CasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84121
UASt-dCasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84120
Ubiq-CasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84118
Ubiq-dCasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84119
Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies Bloomington Drosophila Stock Center 84127
Zymoclean Gel DNA Recovery Kits Zymo Research Corporation D4007
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat Communications. 9, 1911 (2018).
  2. Abudayyeh, O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), 5573 (2016).
  3. East-Seletsky, A., O’Connell, M., Burstein, D., Knott, G., Doudna, J. RNA Targeting by Functionally Orthogonal Type VI-A CRISPR-Cas Enzymes. Molecular Cell. 66 (3), 373-383 (2017).
  4. Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N., Oki, J., Shokhirev, M., Hsu, P. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell. 173 (3), 665-676 (2018).
  5. Buchman, A., Brogan, D., Sun, R., Yang, T., Hsu, P., Akbari, O. Programmable RNA Targeting Using CasRx in Flies. The CRISPR Journal. 3 (3), 164-176 (2020).
  6. Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
  7. Abudayyeh, O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550, 280-284 (2017).
  8. Perrimon, N., Ni, J., Perkins, L. In vivo RNAi: today and tomorrow. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 003640 (2010).
  9. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).
  10. Ni, J., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
  11. Ni, J., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature Methods. 8, 405-407 (2011).
  12. Ni, J., et al. Vector and parameters for targeted transgenic RNA interference in Drosophila melanogaster. Nature Methods. 5, 49-51 (2008).
  13. Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genetics. 208 (3), 853-874 (2018).
  14. Kulkarni, M., et al. Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays. Nature Methods. 3, 833-838 (2006).
  15. Ma, Y., Creanga, A., Lum, L., Beachy, P. Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens. Nature. 443, 359-363 (2006).
  16. Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Matter arising: off-targets and genome-scale RNAi screens in Drosophila. Fly. 1 (1), 1-5 (2007).
  17. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nature Genetics. 40, 476-483 (2008).
  18. Champer, J., Buchman, A., Akbari, O. Cheating evolution: engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations. Nature Review Genetics. 17 (3), 146-159 (2016).
  19. Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008103 (2020).
  20. Mathur, G., Sanchez-Vargas, I., Alvarez, D., Olson, K., Marinotti, O., James, A. Transgene-mediated suppression of dengue viruses in the salivary glands of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Insect Molecular Biology. 19 (6), 753-763 (2011).
  21. Franz, A., et al. Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4198-4203 (2006).
  22. Yen, P., James, A., Li, J., Chen, C., Failloux, A. Synthetic miRNAs induce dual arboviral-resistance phenotypes in the vector mosquito Aedes aegypti. Communications Biology. 1, 11 (2018).
  23. Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic Aedes aegypti expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
  24. . Addgene Available from: https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/ (2020)
  25. Gibson, D., Young, L., Chuang, R., Venter, J., Hutchison, C., Smith, H. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  26. . Addgene Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr/ (2020)
  27. . Indiana University Bloomington Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL (2020)
  28. Dobin, A., et al. STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  29. Jiang, W., Brueggeman, A., Horken, K., Plucinak, T., Weeks, D. Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryotic Cell. 13 (11), 1465-1469 (2014).
  30. Poe, A., et al. Robust CRISPR/Cas9-Mediated Tissue-Specific mutagenesis reveals gene redundancy and perdurance in Drosophila. Genetics. 211 (2), 459-472 (2019).
  31. Port, F., Chen, H., Lee, T., Bullock, S. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient ger mLine and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 2967-2976 (2014).
  32. Yang, S., Li, S., Li, X. Shortening the Half-Life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity. Cell Reports. 25 (10), 2653-2659 (2018).
  33. Port, F., et al. A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila. eLife. 9, 53865 (2020).
  34. Zhang, X., Tee, L., Wang, X., Huang, Q., Yang, S. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 4 (17), 264 (2015).
  35. Huynh, N., Depner, N., Larson, R., King-Jones, K. A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila. Genome Biology. 21, 279 (2020).

Tags

CRISPRCasRxRNA TargetingDrosophila MelanogasterUbiquitousGene Transcript ReductionTwo-component SystemThree-component SystemGRNAUbiq CasRxLuciferasePhenotypeMendelian Genetics

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sun, R., Brogan, D., Buchman, A., Yang, T., Akbari, O. S. Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx. J. Vis. Exp. (168), e62154, doi:10.3791/62154 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image