新しい静的プラットフォームは、タンパク質の細胞内高速光化学酸化(IC-FPOP)と呼ばれるタンパク質フットプリント技術を利用して、ネイティブ細胞環境におけるタンパク質構造および相互作用部位を特徴付けるために使用されます。
タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)と質量分析(MS)を組み合わせることで、タンパク質相互作用、構造、タンパク質の立体構造ダイナミクスを溶媒のアクセシビリティの関数として問い合わせる構造プロテオミクスにおいて非常に貴重なツールとなっています。近年、FPOPの範囲は、ヒドロキシルラジカルプロテインフットプリンティング(HRPF)技術であり、生細胞培養におけるタンパク質標識に拡大され、複雑な細胞環境におけるタンパク質相互作用を研究する手段を提供している。細胞内タンパク質修飾は、細胞内の全てのタンパク質複合体形成に伴うリガンド誘導構造変化または構造変化に関する洞察を提供することができる。タンパク質のフットプリントは、通常のフローベースのシステムと248 nmのKrFエキシマーレーザーを採用して過酸化水素の光分解を介してヒドロキシルラジカルを得るために達成されており、1つの細胞サンプルに対して20分間の分析が必要です。時間分解FPOP実験を容易にするために、新しい6ウェルプレートベースのIC-FPOPプラットフォームの使用が開拓されました。現在のシステムでは、単一のレーザーパルスがウェル全体を1回照射し、FPOP実験時間枠を切り捨て、20秒の分析時間を生じ、60倍の減少を示します。この解析時間が大幅に短縮され、生化学的シグナル伝達カスケード、タンパク質フォールディング、および差動実験(薬物を含まない、薬物に結合した)などの細胞機構を時間依存的に研究することが可能です。この新しい計器は、可動XYステージ(PIXY)を備えたプラットフォームインキュベーターと題され、温度、CO2 および湿度制御を備えたプラットフォームインキュベーターを使用して光学ベンチで直接細胞培養およびIC-FPOPを実行することを可能にします。プラットフォームには、レーザービームガイダンス用の位置決め段階、蠕動ポンプ、ミラー光学装置も含まれています。PIXY における光学構成、流量、過渡性トランスフェクション、および H2O2 濃度などの IC-FPOP 条件が最適化され、査読されています。システムのすべてのコンポーネントを自動化すると、人間の操作が減少し、スループットが向上します。
タンパク質のフットプリント技術は、タンパク質の組織に関する深遠な情報を明らかにすることができます。これらの必須の構造生物学MSベースの技術は、質量分析ツールの構成要素である。これらの方法は、タンパク質高次構造(HOS)と共有標識1、2、3、4を介して相乗効果をプローブする。タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)は、アミノ酸の可溶性側鎖の溶媒を酸化的に修飾するヒドロキシルラジカルを採用している5,6(表1)。この方法は、過酸化水素(H2O2)の光分解のために248nmでエキシマレーザーを利用してヒドロキシルラジカルを生成する。理論的には、20個のアミノ酸のうち19個は、Glyが唯一の例外である酸化的に変えることができる。しかしながら、ヒドロキシルラジカルを用いたアミノ酸の反応速度が変化するため、これらのサブセットのみの改変が実験的に観察されている。それでも、この方法はタンパク質配列5の長さにわたって分析する可能性を秘めている。FPOPはマイクロ秒のタイムスケールでタンパク質を変更し、高速オフレートで弱い相互作用を研究するのに役立ちます。リガンド結合またはタンパク質の立体構造の変化に伴う溶媒のアクセシビリティ変化は、したがって、この方法の力は、タンパク質の標識パターンを複数の状態(すなわち、リガンド結合と比較して自由なリガンド)の比較にある。その結果、FPOPは、タンパク質とタンパク質-リガンド相互作用部位および立体構造変化の領域7、8、9、10の同定に成功している。FPOP法は、精製タンパク質システムの研究から細胞内分析まで拡張されています。細胞内FPOP(IC-FPOP)は、1000以上のタンパク質を酸化的に改変して、プロテオーム11、12の構造情報を提供することができる。従来のIC-FPOPプラットフォームは、レーザービームを越えて単一ファイルを流れるフローシステムを利用しています。このシステムの開発により、個々の細胞はレーザー照射に等しく曝露することができました。これにより、酸化標識タンパク質12の数が13倍に増加した。しかし、流れシステムの制限は、改変が行われる10分間の照射間隔と追加の10分の洗浄サイクルからなる単一のサンプル実験の長さである。IC-FPOPの時間的制約は、生化学的シグナル伝達カスケードにおける相互作用ネットワーク間に存在する短命タンパク質折りたたみ中間体または変化を研究するのに適さない。この時間的な制限は、より高いスループットを備えた新しいIC-FPOPプラットフォームの設計に影響を与えました。
天然細胞環境におけるタンパク質の高次構造を正確に測定するために、新しい設計により、細胞培養をレーザープラットフォームで直接行うことができるため、IC-FPOPは高スループットになります。この設定はまた、接着細胞を基質から除去しなければならない流れを用いたIC-FPOPとは対照的に、細胞環境への最小の摂動を可能にする。新しいプラットホームはレーザービーム指導のための構成されたミラー光学、XY運動のための位置付けシステム、および化学交換のための蠕動ポンプを利用している間、CO2 および温度制御された段階の最室を使用して無菌のインキュベーションシステムでIC-FPOPを起こすことを可能にする。IC-FPOP を実施するための新しいプラットフォームは、可動 XY ステージ (PIXY) を持つプラットフォームインキュベーター (図 1)と題されています。PIXYでは、IC-FPOPは、プラットフォームインキュベーターチャンバー内の6ウェルプレートで成長したヒト細胞に対して行われます。この構成では、XY平面内でインキュベーターを保持する位置決め段階としてビーム適合ミラーを使用して、レーザービームをプレートに下方に反射するので、レーザービームは一度に1つの井戸のみを照射するように戦略的に整列します。検証研究は、IC-FPOPがフローシステムよりもPIXYで速く行われ、タンパク質あたりのアミノ酸修飾の増加につながることを示しています。この新しいIC-FPOPプラットフォームの開発は、細胞実験13から得ることができる知識を説明します。
タンパク質は生きている細胞で仕事の多くを行います。この重要性を考えると、細胞環境におけるタンパク質機能および高次構造(HOS)に関する詳細なデータは、精製システムとは対照的に、細胞内のより大きな複合体および酵素反応における複雑さの理解を深めるために必要である。これを行うために、ヒドロキシルラジカルプロテインフットプリンティング(HRFP)法を採用し、タンパク質の高速光化学酸化(IC-FPOP)と題した。ほとんどのFPOP研究は、結合相互作用およびタンパク質立体構造ダイナミクスに影響を与える混雑した分子環境とは対照的な比較的純粋なタンパク質系 でインビトロで 行われてきた。その結果、 インビトロ 実験18 からの知見と実際の細胞環境で得られるものとの間に、シスムがある。 インビトロ FPOP実験の理想化された条件と細胞の複雑な性質との間のギャップを埋めるために、セルFPOPプラットフォームで新しい自動化された6ウェルプレートベースのギャップが開発されました。この新しいFPOP技術は、これらの分子種を同定し、特徴付け、健康な状態と病気の両方の状態でそれらの動的分子相互作用をトレースすることができる。この新しいプラットフォームは、移動可能 XY ステージ(PIXY)を備えたプラットフォームインキュベーターと呼ばれています。
FPOPは、プロテオーム内の構造情報の特徴付けに成功しました。しかし、すべての生物学的手法には、さらなる改善が必要な特定の制限があります。レーザー光分解時に、かつ、未反応のヒドロキシルラジカルを効率的に焼入れさせるために、特定の試薬が必要です。消化されたペプチドの分離は、構造情報を最大化するために多くの時間を必要とします。この豊富な情報は、MS後のデータ分析1の間に、大量の定量化を必要とすることもできます。レーザープラットフォームでの細胞培養やIC-FPOPに必要な周辺機械を含むプラットフォームインキュベーターには、一部のラボでは実現不可能な大きなコストが付属しています。進歩が続く中、堅牢なソフトウェアおよび分析ツールは、この技術をさらに進める必要があります。その一部は、この研究で紹介されています。このプラットフォームインキュベーターの現在の研究は、HEK293T細胞および C.エレガンスで行われている。このIC-FPOP法は、中国のハムスター卵巣(CHO)、ベロ、MCF-7、およびMCF10-A細胞19を含む多種多様な細胞株との相性が示されている。一般的なIC-FPOP法はこの静的プラットフォームに翻訳可能であるため、これらの細胞株はPIXYを用いた研究にも適しているはずです。
IC-FPOPは、H2O2を利用して、アミノ酸のアクセス可能な側鎖の溶媒を酸化的に修飾し、生物学的文脈を提供する上で有意である生存細胞内のタンパク質相互作用、構造、代謝効果をさらに識別する。H2O2添加後に細胞が生存可能であることを確認することは、IC-FPOP実験の前に不可欠である。細胞生存率試験は、細胞が200 mM 13までのH2O2濃度の存在下で生存可能であることを実証した。また、培地を取り除いた後、H2O2を細胞に直接200 mMの最終濃度で注入することも重要です。細胞培養培地を完全に除去しないと、H2O2の濃度が変化する。標準的な条件と比較して、H2O2濃度を増加させるとともにインキュベーション時間を10秒に増加させることで、プラットフォームインキュベーター内のIC-FPOPによってより多くのタンパク質が修飾された。ポンプが正常に動作し、液体が分散されていることを確認するために使用する前に蠕動ポンプをプライムすることが不可欠です。これを怠ると、チューブ内の気泡、細胞を浸漬するH2O2のボリュームが不十分、および/またはクエンチ溶液の量が不足する可能性があります。
発生する可能性のある別の問題は、システムの不要な遅延です。この例は、統合ソフトウェアを使用して 1000 ミリ秒以上の大きな遅延を追加するポンプ システムの受信コマンドを検証するプロセスです。この問題は、実験中にポンプとの通信を最小限に抑え、事前に設定されたコマンドをできるだけ早く使用することで解決できます。
今後、PIXY の目標は、完全に自動化された統合システムを生産することです。蠕動ポンプに加えて、レーザーパルスのトリガーは自動化される。また、プラットフォームインキュベーターの迅速な移動に新しい測位システムを利用して、速度と精度を向上させます。システムのすべてのコンポーネントは、スループットをさらに向上させるために統合ソフトウェアを使用してプログラムされ続けます。
The authors have nothing to disclose.
この作業は、NIH R01 GM128983-01からの助成金によって支えられた。
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |