Яйцо Микроинъекции и эффективного спаривания для редактирования генома в Firebrat Thermobia domestica
Summary
Мы предоставляем подробный протокол для выращивания, микроинъекции яиц и для эффективного спаривания firebrat Thermobia domestica для генерации и поддержания штаммов мутантов после редактирования генома.
Abstract
Firebrat Thermobia domestica является аметаболическим, бескрылым видом, который подходит для изучения механизмов развития насекомых, которые привели к их успешному эволюционному излучению на Земле. Применение генетических инструментов, таких как редактирование генома, является ключом к пониманию генетических изменений, которые отвечают за эволюционные переходы в подходе Эво-Дево. В этой статье мы описываем наш текущий протокол для генерации и поддержания мутантных штаммов T. domestica. Мы сообщаем о сухом методе инъекций, в качестве альтернативы зарегистрированного метода мокрой инъекции, который позволяет нам получить невероятно высокие показатели выживаемости в инъекционных эмбрионах. Мы также сообщаем об оптимизированной среде для спаривания взрослых и получения последующих поколений с высокой эффективностью. Наш метод подчеркивает важность учета уникальной биологии каждого вида для успешного применения методов редактирования генома для нетрадиционных модельных организмов. Мы прогнозируем, что эти протоколы редактирования генома помогут реализовать T. domestica в качестве лабораторной модели и еще больше ускорить разработку и применение полезных генетических инструментов в этом виде.
Introduction
Thermobia domestica принадлежит к одному из самых базальных заказов насекомых, Зигентоме, который сохраняет предков аметаболический и бескрылый жизненный цикл. Такое базальное филогенетическое положение и родовые характеристики устанавливают этот вид в качестве привлекательной модели для изучения механизмов, лежащих в основе успеха насекомых на Земле, которые охватывают более 70% описанных видов животных1. T. domestica уже давно используется главным образом для изучения родовых характеристик физиологии насекомых из-за его подходящих особенностей в качестве лабораторной модели, таких как относительно короткий жизненный цикл (2,5-3,0 месяца от эмбриона до репродуктивного взрослого; Рисунок 1A) и легкое разведение. В последние три десятилетия, его использование было расширено для изучения родовых характеристик различных черт, таких как план тела, нейронной дифференциации, ициркадные ритмы 2,3,4.
Применение передовых генетических инструментов в T. domestica могло бы еще больше ускорить такой вклад в широкую область исследований. Успешное РНК-интерференция (РНК) – опосредованное нокдаун гена в эмбрионах, нимфах и взрослых было сообщено в T. domestica4,5,6. Эффективность системных РНК по-прежнему сильно зависит от видов, например, она, как правило, высока в coleoptera в то время как она низка в порядке lepidoptera7. Эффективность и продолжительность нокдауна РНК в T. domestica еще предстоит оценить. В дополнение к РНК, мы ранее сообщали об успешном CRISPR/ Cas9-опосредованном генном нокауте в T. domestica8. Система CRISPR/Cas широко применяется для редактирования генома у насекомых, особенно для целевого генного нокаута. Его использование может быть расширено для других приложений, таких как анализ генного репортера, отслеживание клеточной линии и манипуляции транскрипционные действия путем стучать в экзогенныхконструкций послесоздания протокола для доставки компонентов системы CRISPR / Cas в ядра 9 . В сочетании с опубликованнойсборки генома 10, широкое использование и дальнейшее развитие CRISPR / Cas основе редактирования генома в T. domestica будет способствовать исследованиям упором на эволюционные механизмы за выдающийся адаптивный успех насекомых. Здесь мы описываем подробный протокол микроинъекции эмбриона и для спаривания взрослого T. domestica для генерации штамма мутантов с помощью CRISPR/Cas9. Рассматривая этот новый метод, мы обсуждаем важность рассмотрения уникальной биологии нетрадиционных видов моделей для успешного применения этих методов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для успешного поколения желаемого T. domestica мутант с CRISPR/Cas9, в первую очередь важно собрать достаточное количество постановочных эмбрионов для инъекций. Для постоянного сбора достаточного количества яиц T. domestica, ключ должен выбрать соответствующий размер контейнера, чтобы имет…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TO и TD были поддержаны JSPS KAKENHI грант номера 19H02970 и 20H02999, соответственно.
Materials
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
- Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect. Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).
- Farris, S. M. Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect. Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).
- Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica. Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).
- Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).
- Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution. Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).
- Nji, C., et al. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Brand, P., et al. The origin of the odorant receptor gene family in insects. eLife. 7, 1-13 (2018).
- Noble-Nesbitt, J. Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere. Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).
- Sweetman, H. L. Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).
- Nijhout, H. F. . Insect Hormones. , (1994).
- Chen, J., et al. Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations. DNA Research. 19, 423-433 (2012).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).
- Adams, J. A. Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard. Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).
