Ультра-высокоскоростной западный пятно с использованием иммунореакции Повышение технологии
Summary
Ультра-высокоскоростной западный метод blotting разработан путем улучшения кинетики антиген-антител связывания через циклические слива и пополнения (CDR) технологии в сочетании с иммунореакцией повышения агента.
Abstract
Западная помарка (также известная как иммуноблот) является каноническим методом биомедицинских исследований. Он обычно используется для определения относительного размера и обилия конкретных белков, а также пост-трансляционных белковых модификаций. Этот метод имеет богатую историю и по-прежнему широко используется из-за своей простоты. Тем не менее, западная процедура blotting лихо занимает несколько часов, даже дней, чтобы завершить, с критическим узким местом является долго инкубации раз, которые ограничивают его пропускную способность. Эти инкубационные шаги необходимы из-за медленного диффузии антител от раствора навалом до обездвиженные антигены на мембране: концентрация антител вблизи мембраны намного ниже, чем концентрация навалом. Здесь мы представляем новшество, которое резко сокращает эти инкубационые интервалы за счет улучшения связывания антигенов через циклическое осушение и пополнение (CDR) раствора антител. Мы также использовали иммунореакцию повышения технологии для сохранения чувствительности анализа. Сочетание метода CDR с коммерческим иммунореакцией повышающий агент увеличило выходной сигнал и существенно сократило время инкубации антител. В результате ультра-высокоскоростной западной пятно может быть достигнуто в 20 минут без потери чувствительности. Этот метод может быть применен к западным пятнам, используя как хемилюминесцентные, так и флуоресцентные обнаружения. Этот простой протокол позволяет исследователям лучше исследовать анализ экспрессии белка во многих образцах.
Introduction
Западная помарка (также известная как иммуноблот) является мощным и фундаментальным методом в широком диапазоне научных и клинических дисциплин. Этот метод используется для изучения присутствия, относительного изобилия, относительной молекулярной массы и пост-трансляционных модификаций белков1. В сочетании с цифровым анализом изображений, этот метод может надежно анализировать обилие белков и белковых модификаций2. Хотя западная помарка выполняется регулярно, это трудоемкий и трудоемкий метод. Требуются длительные инкубации антител с мембранами. Здесь мы описываем модификацию метода инкубации, которая преодолевает это ограничение без ущерба для чувствительности.
Во время инкубации мембраны антитела плавают в растворе, в то время как антигены обездвижены на мембране. Из-за их высокой близости, скорость связывания антител к антигену быстрее, чем диффузия антител от массового раствора к мембране. Это создает низкую концентрацию “слой истощения”(рисунок 1). Это может занять несколько часов для более отдаленных антител, чтобы достичь мембраны через пассивную диффузию, которая является основным фактором, ответственным за долгое время инкубации в этой технике. Этот эффект называется ограничением общественного транспорта (MTL)3. Было предложено, что повторяющиеся слива и пополнения антител содержащие раствор может нарушить слой истощения и преодолеть MTL4. Здесь мы разработали уникальный метод, который реализует эту циклическую концепцию осушения и пополнения (CDR), чтобы уменьшить эффект MTL в традиционном западном протоколе blotting и заметил, сократить необходимый инкубационный период.
Для того, чтобы сохранить чувствительность обнаружения с коротким временем инкубации, мы использовали иммунореакцию повышения технологии, которая ускоряет реакцию антиген-антитела, тем самым улучшая соотношение сигнала кшуму 5. Многие коммерчески доступные иммунореакции повышения агентов (IRE) состоят из 2 компонентов (Решение 1 и 2, см. Таблицу материалов). Запатентованный состав или механизм действия IRE не был раскрыт, но мы ранее обнаружили, что IRE уменьшила константу диссоциации между антигеном и антителами в твердых фазообразующих анализах, что указывает на увеличение сродства, по крайней мере частично, ответственного за усиливающий эффект IRE6. Сочетание CDR с IRE дает ультра-высокоскоростной западный протокол blotting, который уменьшает все время процедуры без ущерба для чувствительности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Западная помарка широко используемая аналитическая техника для того чтобы обнаружить специфически протеины которые были натыся 40 леттому назад 7,8. С тех пор техника продолжает развиваться, с последующими нововведениями, улучшая чувствительность, скоро…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Отделом интрамуральных исследований, Национальным институтом сердца, легких и крови, Национальными институтами здравоохранения. S.H. была поддержана Японской программой государственно-частного партнерства по обучению студентов за рубежом, а H.N. и K.Y. были стипендией Valor и V Drug Overseas Training Scholarship.
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. “Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
