Makrorheologische Charakterisierung von Kiemen-Raker-Schleim im Silberkarpfen, Hypophthalmichthys molitrix

Der Silberkarpfen( Hypophthalmichthys molitrix) ist ein planktivorer Filterfresser und eine invasive Art, die mehrere natürliche Wasserstraßen in den Vereinigten Staaten infiltriert hat. Diese Art wurde ursprünglich im oberen Mississippi River Becken eingeführt, um Algenblüten^1,2,3zu kontrollieren. Der Silberkarpfen ist ein äußerst effizienter Feeder. Typischerweise reichen die Partikelgrößen der Verbrauchsmaterialien von 4 bis 20 μm bis zu größerem Zooplankton, das etwa 80 μm^3,4,^5beträgt. Diese Art hat andere einheimische Fische ihnen abverdlichtet und kann durch die Begrenzung der verfügbaren Ressourcen enorme Schäden an einheimischen Wasserstraßen verursachen^1,2,6. So stellen filterfütterende Fische wie der Silberkarpfen und der Großkopfkarpfen eine große Bedrohung für die Großen Seen^{dar 1,2,6,7,8}.

Filterfütternde Fische besitzen spezielle Organe, die als Kiemenrechen (GRs) bezeichnet werden, wobei sich eine dünne Schleimschicht auf ihrer Oberfläche befindet. Diese Organe verbessern die Effizienz der Filtration und Aggregation kleiner Partikel aus der ankommenden Flüssigkeit. Ziel des hier vorgestellten Protokolls ist es, die nicht-newtonsche, scherverdünnende Materialeigenschaft und streckgrenze des GR-Schleims zu charakterisieren, der von der innenfläche der Kiemenrechen im Silberkarpfen gewonnen wird. Der mit einem Rotationsrheometer ermittelte Wert der Streckgrenze des GR-Schleims ist in dieser Studie von Interesse. Die gemessene Streckgrenze, auch “scheinbare Streckgrenze” genannt, hängt von den Prüfverfahren wie Steady Shear Rate- oder Dynamic Oscillatory Strain-Typ⁹,^10ab. Die scherverdünnende ” Streckgrenzerflüssigkeit” durchläuft einen Übergang von festem zu flüssigkeitsähnlichem Verhalten bei einer kritischen angelegten Spannung^9,11. Die scheinbare Streckgrenze ist die minimale Scherspannung, die erforderlich ist, um eine Strömung einzuleiten, oder die, bei der eine irreversible plastische Verformung zuerst beobachtet wird, wenn der Schleim von einem gelartigen Material zu einem flüssigkeitsähnlichen Material übergeht. Dieses Verhalten kann in strukturierten viskoelastischen Materialien beobachtet werden. Der Übergang vom gelartigen zum flüssigkeitsähnlichen Verhalten des GR-Schleims beinhaltet zwei Funktionen, d.h. eine Kleberolle zum Sammeln von Lebensmittelpartikeln und eine Transportfahrzeugrolle zur Unterstützung des Partikelabgabe- und Filtrationsprozesses. Die erweiterte Funktion des Schleims umfasst die Schaffung von Diffusionsbarrieren bei krankheitsresistenz und Atmung, die kontrollierte Freisetzung von Ernährungsfaktoren, toxischen Komponenten und Ausscheidungen, die Schaffung von Stoffwechselwegen für die Fütterung und Verschachtelung, die Unterstützung beim Schutz von Raubtieren und die Erzeugung von Grenzschichtmodifikationen, die die Fortbewegung und die Antriebseffizienz verbessern^12,13,14.

Im Gegensatz zu einfachen Flüssigkeiten besitzen komplexe Flüssigkeiten wie der Schleim Eigenschaften, die mit den Strömungsbedingungen variieren und zusätzliche Messparameter erfordern, um ihr physikalisches Verhalten im Großmaßstab zu definieren. Zur Überwachung der Viskosität und Streckgrenze von GR-Schleim werden rheologische Messungen mit einem Rotationsrheometer durchgeführt. Das Rotationsrheometer wendet eine stetige oder oszillierende Scherspannung oder -dehnung mittels einer rotierenden Scheibe in Kontakt mit der Flüssigkeitsprobe an und misst deren Reaktion. Der Grund für die Verwendung dieses Instruments und dieser Technik ist, dass das Rheometer eine Reihe von Messungen liefern kann, um die Materialeigenschaften des GR-Schleims des Silberkarpfens zu beschreiben, die nicht allein durch viskose definiert werden können.

Der Schleim ist ein viskoelastisches Material und seine mechanische Reaktion auf eine auferlegte Verformung liegt zwischen der eines reinen Feststoffs (geregelt durch das Hookesche Elastizitätsgesetz) und der einer reinen Flüssigkeit (geregelt durch das Newtonsche Viskositätsgesetz)^15,16. Das komplexe makromolekulare Netzwerk, das im Schleim enthalten ist, kann sich als Reaktion auf äußere Kräfte oder Verformungen dehnen und neu ausrichten. Ein Rotationsrheometer besteht aus einer Kegelgeometrie und einer Peltierplatte, wie in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigt (siehe Tabelle 1 für Die Spezifikationen der Instrumentierung). Ziel dieser Studie war es, ein Protokoll zur Bestimmung der rheologischen Eigenschaften des GR-Schleims zu entwickeln. Ein Vorteil des Rotationsrheometers gegenüber einem Viskosimeter ist seine Fähigkeit, dynamische Messungen mit kleinen Probenvolumina durchzuführen. Das GR-Schleimprobenvolumen in dieser Studie betrug etwa 1,4 ml. Das Viskosimeter hingegen ist auf konstante Scherraten beschränkt und erfordert große Probenvolumina.

Es wird erwartet, dass die rheologischen Eigenschaften des Schleims innerhalb der Anatomie des Silberkarpfens stark variieren. Zum Beispiel können sich die Eigenschaften des Schleims, der sich auf den GR-Oberflächen befindet, vom Epibranchialorgan unterscheiden. Um die potenzielle Variabilität der Schleimeigenschaften in verschiedenen Regionen der Fische zu berücksichtigen, wurde die erworbene GR-Schleimprobe verdünnt und Lösungen mit drei Konzentrationen wurden mit dem Rotationsrheometer erstellt und getestet. Die nach Der Durchführung des Protokolls gemeldeten Daten und Ergebnisse zur Schleimrheologie zeigten die Wirksamkeit der Messtechnik. Die in diesem Artikel vorgestellten illustrativen Daten sind nicht dazu gedacht, über die gesamte Silberkarpfenpopulation verallgemeinert zu werden. Das hier vorgestellte Protokoll kann erweitert werden, um die Schleimrheologie über größere Stichprobensätze hinweg zu untersuchen, um andere Hypothesen zu testen.

Ziel dieser Studie ist es, die Variation der rheologischen Eigenschaften der GR-Schleimrheologie mit drei verschiedenen Schleimkonzentrationen (400 mg/ml, 200 mg/ml und 100 mg/ml) nachzuweisen. Die Konzentration von 400 mg/ml stellt die rohe Schleimprobe dar, die aus den Fisch-GRs gewonnen wurde. Deionisiertes Wasser (DI) wurde verwendet, um die rohe Schleimprobe in Konzentrationen von 200 mg/ml und 100 mg/ml zu verdünnen. Die Verdünnung der Schleimproben ermöglichte die Beurteilung des Scherausdünnungsgrades und der scheinbaren Streckgrenze in Abhängigkeit von der Konzentration und die Bestimmung der Konzentration, bei der der GR-Schleim in ein nicht-newtonsches Verhalten übergeht. Ein Shaker wurde verwendet, um große Schleimklumpen in den Proben abzubauen, um Fehler in den rheologischen Daten aufgrund von Inhomogenität zu mildern.

Bei den meisten Wirbeltieren, einschließlich Fischen, sind die vorherrschenden schleimbildenden Makromoleküle Glykoproteine (Muzinine), die dazu neigen, durch Verwicklungen oder chemische Vernetzung im Wasser aufzuquellen und ein gelartiges Material zu erzeugen^{12,13,17,18,19,20}. Die hochmolekularen, gelbildenden Makromoleküle und der hohe Wassergehalt spiegeln die Rutschigkeit im Schleim^{wider 13}. Ein hohes Maß an intermakromolekularen Wechselwirkungen führt zur Gelbildung, während geringere intermakromolekulare Wechselwirkungen oder gebrochene Bindungen zu hochviskosen Flüssigkeiten führen²¹.

Die Prozesse der Lebensmittelpartikelfiltration in filterfütternden Fischen werden durch GR-schleimbezogene Eigenschaften wie Kohäsion und Viskosität unterstützt, die ihr Adhäsionspotenzial und ihre Haftung bestimmen²². Die Stärke der schleimbasierten Adhäsion hängt von spezifischen intermolekularen, elektrostatischen oder hydrophoben Wechselwirkungen ab²³. Sanderson et al.²⁴ führten eine Suspensionsfütterungsstudie an Schwarzfischen durch, in der sie die Beweise für schleimbasierte Adhäsion fanden. Sie stellten fest, dass auf die Adhäsion von schwebenden Lebensmittelpartikeln mit einer Schleimhautoberfläche der Transport von aggregierten Partikelklumpen folgt, die durch gerichteten Wasserfluss, der darauf einwirkt, mit Schleim verbunden sind²⁴. Der Schleim, der Scherdehnungsraten ausgesetzt ist, die durch den Wasserfluss erzeugt werden, erleichtert die Abgabe von Nahrungspartikeln an die Verdauungsorgane. Endoskopische Techniken wurden verwendet, um gefilterte Partikel zu beobachten²⁴.

Literatur über den Bereich der Scherraten und praktischen Grenzen bei der rheologischen Untersuchung von GR-Schleim ist knapp. Daher wurde eine Orientierung aus rheologischen Studien zu Magen-, Nasen-, Zervix- und Lungenschleim, Lachshautschleim, Hagfish-Schleim und Knochengelenk-Oberflächenschmiermittel gesucht, wobei die rheologische Charakterisierung und nicht-newtonsche Attribute untersucht wurden^11,12,^{25,26,27,28,29,30,31}. In jüngerer Zeit wurde die Wirkung von Fischhautschleim auf die Fortbewegung und die Antriebseffizienz mittels Viskosimetrie mit konstanter Scherrate untersucht. Untersuchungen zur Hautschleimrheologie (ohne Verdünnung oder Homogenisierung) in Bezug auf Brasse, Wolfsbarsch und magere Zeigten nicht-newtonsches Verhalten bei typischerweise niedrigen Scherraten¹⁴.  In einer anderen verwandten Studie wurde festgestellt, dass die rohen Hautschleimproben von dorsalen und ventralen Seiten der senegalesischen Seezunge ein nicht-newtonsches Verhalten zeigen, was auf eine höhere Viskosität des ventralen Schleims bei allen Scherraten hinweist, die als³²betrachtet werden. Andere rheologische Protokolle zur Hydrogelgerüstentwicklung und für hochkonzentrierte Suspensionen unter Verwendung eines Viskosimeters mit konstanter Scherrate wurden ebenfalls in der Literatur^33,34berichtet.

In dieser Studie wurden die GR-Schleimeigenschaften mit einem dehnungskontrollierten Rotationsrheometer untersucht, das in rheologischen Experimenten an komplexen biologischen Flüssigkeiten weit verbreitet ist²⁵. Bei Newtonschen Flüssigkeiten bleibt die scheinbare Viskosität konstant, ist scherratenunabhängig und die Scherspannungen variieren linear mit den Scherdehnungsraten (Abbildung 3A, B). Für nicht-newtonsche Flüssigkeiten (z. B. Scherverdünnungsflüssigkeiten) ist die Viskosität scherratenabhängig oder verformungsverlaufsabhängig (Abbildung 3A, B). Der Verlustmodul (G”) stellt das Ausmaß dar, in dem das Material der Strömungsneigung widersteht und ist repräsentativ für die Flüssigkeitsviskosität (Abbildung 4). Der Speichermodul (G’) stellt die Tendenz des Materials dar, nach spannungsinduzierter Verformung seine ursprüngliche Form wiederzuerlangen und entspricht der Elastizität (Abbildung 4). Der Phasenwinkel (δ) oder Verlusttangentenwert wird aus der inversen Tangente von G”/G’ berechnet. Es stellt das Gleichgewicht zwischen Energieverlust und -speicherung dar und ist auch ein gebräuchlicher Parameter zur Charakterisierung viskoelastischer Materialien (δ = 0° für einen Hookean-Feststoff; δ = 90° für eine viskose Flüssigkeit; δ 45° für eine viskoelastische Flüssigkeit) (Abbildung 4)²⁵. Die scheinbare Streckgrenze (σ_y)in strukturierten Fluiden stellt eine Zustandsänderung dar, die in rheologischen Daten aus stationären Sweeps und dynamischen Spannungs-Dehnungs-Sweeps¹⁰beobachtet werden kann. Wenn die extern angelegte Spannung geringer ist als die scheinbare Streckgrenze, verformt sich das Material elastisch. Wenn die Spannung die scheinbare Streckgrenze übersteigt (in Abbildung 3Bals “mittlere Spannung” gekennzeichnet), wechselt das Material von elastischer zu plastischer Verformung und beginnt in seinem flüssigen Zustand zu fließen³⁵. Die Messung des Speichermoduls (G’) und des Verlustmoduls (G”) in der Schleimprobe unter oszillierenden Spannungsbedingungen (oder Dehnungsbedingungen) quantifiziert die Änderung des Materialzustands von gelartigem zu viskoelastischem flüssigkeitsähnlichem Verhalten.

Die Arten von Rheometertests, die zur Überwachung von Daten in Bezug auf Speichermodul (G’), Verlustmodul (G”) und scheinbare Viskosität (η) durchgeführt werden, werden hier beschrieben. Die dynamischen Schwingungstests (Dehnungs-Sweeps und Frequenz-Sweeps) überwachten G’ und G’ unter kontrollierter Schwingung der Kegelgeometrie. Die dynamischen Dehnungsfegentests bestimmten den linearen viskoelastischen Bereich (LVR) des Schleims durch Überwachung der intrinsischen Materialreaktion (Abbildung 4). Dehnungsfegen wurden verwendet, um das Nachgiebverhalten bei konstanter Schwingungsfrequenz und Temperatur zu bestimmen. Die dynamischen Frequenz-Sweep-Tests überwachten die Materialreaktion auf steigende Frequenz (Verformungsrate) bei konstanter Amplitude (Dehnung oder Spannung) und Temperatur. Für die dynamischen Frequenz-Sweep-Tests wurde die Dehnung im linearen viskoelastischen Bereich (LVR) aufrechterhalten. Die stationären Scherratentests überwachten die scheinbare Viskosität (η) unter stetiger Rotation der Kegelgeometrie. Der GR-Schleim wurde inkrementellen Belastungsschritten ausgesetzt und die scheinbare Viskosität (η, Pa.s) auf unterschiedliche Scherrate (ý, 1/s) überwacht.

Das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll behandelt den GR-Schleim als ein komplex strukturiertes Material unbekannter Viskoelastizität mit einem bestimmten linearen viskoelastischen Reaktionsbereich. Der Fischschleim wurde aus den GRs des Silberkarpfens während eines Angelexpeditions am Hart Creek im Missouri River von Professor L. Patricia Hernandez (Department of Biological Sciences, The George Washington University) ^1,2,36extrahiert.  Eine Anordnung von GRs im Mund eines Silberkarpfens ist in Abbildung 5A und eine schematische Zeichnung in Abbildung 5Bdargestellt. Ein ausgeschnittener GR ist in Abbildung 5Cdargestellt.  Die Extraktion von Schleim aus GRs des Silberkarpfens wird als Beispiel in den schematischen Zeichnungen dargestellt, Abbildung 5D, E. Alle Rheometertests wurden unter einer konstanten, kontrollierten Temperatur von 22 ± 0,002 °C durchgeführt, die temperatur aufgezeichnet am Fangort^1,2,36.  Jede Schleimprobe wurde dreimal mit dem Rheometer getestet, und die gemittelten Ergebnisse werden zusammen mit den statistischen Fehlerbalken dargestellt.