멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

단백질 단백질 상호 작용 (PPI)은 단백질의 구조와 기능의 유지에서 전체 시스템의 조절에 이르기까지 생물학 전반에 걸쳐 중추적 인 역할을합니다. PPI는 다양한 형태로 제공되며 형성되는 상호 작용 유형에 따라 분류될 수 있습니다. 이러한 분류중 하나는 상호작용이 동일한 하위 단위 또는 하위 단위로 작용하는 다른 단백질 사이의 여부에 따라 호모올리고메릭 또는 이종성고름입니다. 또 다른 분류는 상호 작용이 안정적인 복합체 또는 일시적인 복잡한 상태의 형성으로 이어지는 경우 상호 작용의 강도를 기반으로합니다. 단백질 간의 PPI에 대한 구조적 정보는 단백질이 기능을 수행하는 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 단백질의 80% 이상이 기능성 역할^1을수행하기 위해 복잡한 형성에 의존하는 것으로 추정되고 있다. 생물학에서 그들의 중요성을 제대로 작동하기 위해 PPI에 의존하는 것으로 관찰된 단백질의 비율을 감안할 때, 그러나 이러한 상호 작용에 관여하는 단백질을 제대로 조사 할 수 있다는 것은 단백질이 PPI를 형성할 때 실험적으로 관찰할 수 있는 기술의 제한으로 인해 도전적인 남아 있다.

많은 실험적으로 결정된 PPI에 대한 결과 사이에 는 높은 수준의 노이즈, 거짓 긍정 및 현재 사용 가능한 PPI 결정 기술의 많은에서 파생된 거짓 네거티브로 인해 높은 수준의 불일치가 있습니다. 이는 특히 효모 2하이브리드(Y2H) 시스템, 탠덤 친화정화질량 분광법(TAP-MS), 및 형광공명에너지전달(FRET)에 대해 PPI 결정^{2,3,4,5,6,7에}가장 일반적으로 사용되는 세 가지 방법을 나타낸다. 이에 비해, 핵자기공명(NMR), X선 결정학 및 전자 현미경검사(EM)와 같은 단백질 구조 생물학 기술은 단백질-단백질 상호작용에 대한 고해상도 구조 정보를 원자 수준으로 끌어올리고 목표 단백질에 대한 직접적인 시각적 확인을 가능하게 하는 데 사용될 수 있다. 현재 이용 가능한 비구조적 기반 PPI 결정 연구 기술(예를 들어, Y2H, TAP-MS 및 FRET)은 이러한 능력이 부족하고 단백질⁵사이의 약하고 일시적인 상호 작용을 식별하는 데 어려움을 겪습니다. 이러한 단점은 적절한 사분위 구조와 이종복합 조립체의 형성에 영향을 미치는 지질 환경의 추가 변수에 의해 추가된 복잡성으로 인해 멤브레인 단백질을 연구할 때 더욱 강화된다.

막 단백질은 프로테아메의 큰 부분을 구성하고 모든 살아있는 유기체 내에서 작동하는 적절한 세포에서 많은 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있습니다. 멤브레인 단백질이 인간 게놈의 27%를 구성하고 모든 현재 약물 표적의 ~60%를 구성하는 것으로 추정되고 있음에도 불구하고 모든 발표된 단백질 구조의 ~2.2%를 구성하는 막 단백질에 대한 해결된 모델의 수에 큰 이상이 있다^8,9,10. 구조적 정보의 가용성에 있는 불일치의 1 차적인 원인은 막 단백질 자체의 본질적인 속성에 있습니다. 열악한 용해도, 토착 구조 및 기능을 유지하기 위한 지질 환경과의 상호 작용에 대한 의존, 지질막 자체의 다양한 물리화학적 특성으로 인해 멤브레인 단백질은 이를 연구하기 위해 구조 생물학 기술을 구현할 때 상당한 문제를 계속 나타냅니다. 이러한 본질적인 특성 중 정확한 구조 정보를 얻는 데 가장 중요한 것은 자연적인 지질 환경과의 상호 작용이 기본 구조와 기능을 유지하는 요구 사항입니다. 지질환경은 멤테인의 개념(멤브레인과 단백질의 조합)이 멤테인의 개념과 기능의 구조 및 기능의 일체적인 부분으로, 막 단백질 구조 및^{기능(11)의}기본 단위로 제안되었다. 지질 단백질 상호 작용의 중요성에도 불구하고 현재 사용 가능한 구조 기반 PPI 결정 기술은 종종 연구중인 단백질이 용해되거나 세제로 용해될 것을 요구합니다. 가혹한 세제에 노출은 단백질을 변성하거나 탈지때문에 거짓 긍정과 부정적인 원인이 될 수 있습니다, 이는 응집, 단백질의 거부, 비 공유 상호 작용의 해리, 인공 올리고머 상태의 형성을 유도할 수 있습니다. 본인의 골막 단백질의 정확한 측정을 위한 천연 지질 환경을 유지해야 하기 때문에, 이전에 보고된 스티렌 말레산 지질 입자(SMALP)¹³ 방법에 기초하여 네이티브 세포막 나노입자 시스템(NCMNs)^12를 개발하였다.

SMALP는 막 활성 폴리머로서 스티렌 남성산 합분자를 사용하여 막 단백질을 추출하고 용해시킵니다. Poly(Styrene-co-Maleic Acid) (SMA)는 소수성 스티렌 폭정과 정반대의 성수성 남성산 폭정으로 인하여 독특한 수륙양용 폴리머입니다. pH 의존식^{메커니즘(14)에서}세포막을 흡착, 불안정화 및 방해함으로써 나노입자를 형성한다. SMA의 이러한 기능적 활성은 막 단백질 추출 및 용윤화를 위한 세제 없는 시스템으로 활용할 수 있게 해줍니다. NCMN 시스템은 여러 측면에서 SMALP 시스템과 구별됩니다. NCMN 시스템의 가장 독특한 특징은 안정성과 네이티브 기능을 위해 다른 조건을 필요로 하는 많은 다른 멤브레인 단백질의 분리에 적합한 독특한 특성을 갖는 다수의 폴리머를 가진 멤브레인 활성 폴리머 라이브러리를 가지고 있다는 것입니다. NCMN 시스템은 또한 나노 입자를 제조할 때 SMALP 방법에 비해 다른 프로토콜을 갖는다. 이러한 예 중 하나는 NCMN이 고해상도 구조 결정에 대한 단일 단계 니켈 친화성 컬럼 정제를 사용한다는 것입니다. 이러한 상이한 프로토콜의 효과는 3.2 및 3.0 Å 극저온-EM AcrB 구조를 생성한 NCMNs 프로토콜을 비교할 때 관찰될 수 있으며, SMALP 방법을 이용한 유사한 연구와 함께 8.8 Å 해상도^12,15에서극저온-EM AcrB 구조를 초래하였다. NCMN 시스템의 이러한 독특한 기능은 이전에 설립 된 SMALP 방법에 대한 개선이며 PPI 연구에 이상적인 후보입니다.

다중 약물 efflux 수송기 AcrB는 대장균^12에서기능적 균질트리머로 존재한다. 돌연변이 분석은 AcrB 트리머의 안정성을 담당하는 루프에 위치한 단일 P223G 점 돌연변이가 트리머 상태를 불안정하게 하고, 제지 DDM으로 제조할 때 AcrB 단조량을 산출하는 것으로 제안되었으며, 이는 네이티브 블루 젤^{전광전지질(16)으로}검출될 수 있다. 그러나, AcrB-P223G 돌연변이의 FRET 분석은 네이티브 세포막 지질 이중층 환경에서, 돌연변이 AcrB-P223G의 대다수가 여전히 트리머로 존재하고 야생 형 AcrB 및 AcrB-P223G 모두에 대한 발현 수준이 유사하다는 것을 건의했다. 그러나 FRET 분석 결과에도 불구하고, 돌연변이 수송기의 활동 분석은 야생 형^16에비해 활동이 극적으로 감소하는 것으로 나타났다. FRET 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 분석을위해 널리 사용되고 있지만, 연구에 따르면^{17,18,19,20의}거짓 긍정을 자주 줄 수 있는 것으로 나타났습니다.

최근에는 AcrB 트리머의 고해상도 극저온-EM 구조가 NCMNs^12의사용을 통해 관련 토종 세포막 지질 이중층과 AcrB의 상호작용을 보여 주었다. 원칙적으로, NCMNs는 네이티브 세포막에서 발견되는 단백질-단백질 상호 작용의 분석을 위해 쉽게 활용될 수 있다. 본 시스템의 시험에서, 본래 세포막 나노입자 및 음의 염색 전자 현미경검사를 사용하여 AcrB-P223G의 올리고메황 상태를 직접 관찰하기 위한 실험이 수행되었다. 야생형 AcrB 나노입자와 비교하기 위해, NCMN 라이브러리에서 NCMNP1-1로 인덱싱된 동일한 멤브레인 활성 폴리머(SMA2000)를 사용했으며, NCMN^{라이브러리(12)에서}발견되는 대체 폴리머의 고해상도 극저온-EM 구조 판정에 사용하였다. 이전에 보고된 결과에 기초하여, AcrB-P223G 돌연변이의 대다수가 트리메릭 네이티브 세포막^{나노입자(21)의}형태로 존재할 것으로 예상되었다. 그러나, 야생형 AcrB로 관찰된 것과 같은 샘플에는 AcrB 트리머가 발견되지 않았다. 이것은 AcrB-P223G의 대다수가 이전에 제안된 대로 네이티브 세포막에 트리머를 형성하지 않는다는 것을 건의합니다.

여기서 우리는 NCMN을 사용하여 야생 형 대장균 AcrB와 비교하여 돌연변이 대장균 AcrB-P223G의 상세한 분석을 보고합니다. AcrB의 이 사례 연구는 NCMNs가 단백질 단백질 상호 작용 분석을 위한 좋은 시스템임을 시사합니다.