Bu makalenin amacı, insan hepatik progenitörlerin pluripotent kök hücrelerden farklılaşmasına neden olmak için standartlaştırılmış bir yaklaşım sağlamaktır. Bu prosedürün kullanıma hazır ortam formülasyonları ile geliştirilmesi, kullanıcıya biyomedikal araştırma ve çeviri için insan karaciğer hücreleri üretmek için bir facile sistemi sunmaktadır.
Karaciğer hastalığı küresel sağlık sorunudur. Karaciğer nakli etkili bir tedavi şekli olmakla birlikte, donör organ mevcudiyetindeki eksiklikler nedeniyle hasta ölümleri artmıştır. Organ kıtlığı, temel araştırmalar ve klinik için insan hepatositlerinin rutin tedarikini de etkiler. Bu nedenle, insan karaciğeri progenitör hücrelerinin yenilenebilir kaynaklarının geliştirilmesi arzu edilir ve bu çalışmanın amacıdır. İnsan karaciğer atalarını büyük ölçekte etkili bir şekilde üretebilmek ve konuşlandırabilmek için tekrarlanabilir bir hepatik progenitör farklılaşma sistemi geliştirilmiştir. Bu protokol, çeşitli hücre kültürleri formatlarında kullanıcılar arasında deneysel tekrarlanabilirliğe yardımcı olur ve hem insan embriyonik hem de indüklenmiş pluripotent kök hücre çizgilerini kullanarak farklılaşmalara izin eder. Bunlar, temel araştırmaları geliştirecek ve klinik ürün geliştirmeye giden yolu açabilecek mevcut farklılaşma sistemlerine göre önemli avantajlardır.
Karaciğer hastalığı küresel bir sağlık zorluğunu temsil eder ve dünya çapında yılda yaklaşık 2 milyon ölüme neden olur1. Hepatik hastalıkları incelemek ve klinik olarak müdahale etmek için bir dizi model sistemi mevcut olsa da, hücre bazlı sistemlerin rutin kullanımı önemli dezavantajlarla sınırlıdır (bir inceleme için bkz. Szkolnicka vd.2). Gelişmiş insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültürü ve somatik hücre farklılaşmayöntemleri,klinik için temel biyomedikal araştırmalar ve farklılaştırılmış hücrelerin yenilenebilir kaynakları için araçlar geliştirmek için umut verici teknolojileri temsil eder3,4.
Bugüne kadar, hepatosit benzeri hücre (HLC) farklılaşması için birden fazla protokol geliştirilmiştir5,6,7,8. Bu protokoller, küçük moleküller ve büyüme faktörlerinin bir kombinasyonunu kullanarak insan karaciğer gelişiminin yönlerini yeniden yaratmaya çalışır9,10. Çoğu protokol, hPSC’lerin kesin endoderm için astarlandığı, ardından hepatik progenitör spesifikasyonu11 , 12,13ve HLC spesifikasyonu ile biten adımsal bir farklılaşma işleminden oluşur. Bu protokoller tarafından üretilen HLC’ler fetal ve yetişkin fenotiplerinin bir karışımını gösterir. Bu, HNF4α ve albümin (ALB) gibi hepatosit belirteçleri gibi alfa fetoprotein (AFP) ifadesinin yanı sıra14 , 15,16ilaç metabolizasyon kapasitesini içerir. Laboratuvarlar arasında HLC farklılaşması değişebilir; bu nedenle, standartlaştırılmış protokollerin geliştirilmesi gereklidir. Bu, araştırmacıların kök hücre türevi HC’leri temel ve klinik araştırmalar için büyük ölçekte etkili bir şekilde üretmelerini ve uygulamalarını sağlayacaktır.
Takip edilmesi kolay kılavuzlar kullanılarak hem insan embriyonik hem de indüklenmiş pluripotent kök hücre hatlarına uygulanabilen hepatik progenitör farklılaşma sistemi geliştirilmiştir. Bu prosedür, hücre kültürü şişelerinden 96 kuyu plakasına kadar değişen kültürsel formatlarda homojen hepatik progenitör popülasyonları verir. Aşağıda kök hücre türevi hepatik progenitörlerin 24 ve 96 kuyu formatlarında üretilmesi protokolü verilmiştir.
Aşağıda sunulan protokolde kullanılan hücre yoğunluğu sırasıyla 24 ve 96 kuyu plakasının bir kuyusu için belirtilmiştir (bkz. Tablo 1). Farklı hücre kültürü plaka biçimleri ve hücre çizgileri için başlangıç hücre numarasının en iyi duruma getirilmesi gerekir. Protokol optimizasyonu için önerilen başlangıç hücresi yoğunluğu 2 x 105 hücre/cm2’dir. Yoğunluk optimizasyonu için, aynı anda 50.000 hücre/cm2 ± eklenerek birkaç hücre yoğunluğu test edilebilir.
Pluripotent kök hücrelerden büyük ölçekte insan hepatik progenitör hücrelerin üretilmesi, kadavradan elde edilen malzemeye umut verici bir alternatifi temsil edebilir. Protokol standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği, biyomedikal araştırmalar için teknoloji çevirisi ve etkisi sağlamak için anahtardır. Bunu ele almak için, önceki çalışmalar tanımlanmış katkı maddeleri ve matrisler 15 , 23 , 24 ,25,26,27,28kullanarak hESC ve iPSC’lerden adım adım bir farklılaşma protokolü geliştirmeye odaklanmıştır. Bunu yaparak, hepatosit fenotip ve tekrarlanabilirlik geliştirilmiştir, farklılaşma sürecinin yarı otomasyona izin verilir19. Sunulan sistem, raf dışı hücre kültürü ortamı ve facile hepatosit farklılaşma sistemi ile kombinasyonu ile güçlendirilmiştir.
Daha önce, farklılaşma protokolü başlamadan önce pluripotent hücre yoğunluğu, hepatik progenitör hücrelerin homojen popülasyonunu elde etmek için anahtar bir değişken olarak vurgulanmıştır26. Bu daha rafine prosedürü kullanarak, bir dizi başlangıç hücresi yoğunluğu kullanarak adım adım çok sayıda kök hücre türevi hepatik progenitör oluşturmak mümkündür (Tablo 1). 5. günde, kesin endoderm indüksiyonu Sox17 boyama ile doğrulandı (Şekil 3). Kesin endoderm içine verimli ve sağlam farklılaşma hem test esc hem de iPSC hatları ile elde edildi, fazla ifade 80% Sox17 (Şekil 3). 10. günde, hepatik progenitörler tek tip parke taşı benzeri bir morfoloji sergilediler ve karaciğer kök hücre belirteçleri hem AFP hem de HNF4α için oldukça zenginleştirilmişti (%>86, Şekil 4). Manuel ve yarı otomatik teknolojilerin bir kombinasyonunu kullanarak, birden fazla plaka formatında farklılaşma gerçekleştirmek mümkündü19.
Mevcut haliyle, hücre farklılaşması in vitro bazlı deneyler için uygundur. Bununla birlikte, homojen bir hepatik progenitör popülasyonunun doğuma hazır olduğundan emin olmak için klinik uygulamadan önce hücre zenginleştirmesi gerekecektir.
Sonuç olarak, burada açıklanan protokol, alana büyük ölçekte hepatik atalar üretmek için standart bir yaklaşım sağlar. Gelecekteki çalışmalar, sonraki HLC farklılaşması, olgunlaşması ve bakımı için yeni bir ortamın üretimine odaklanacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma MRC Doktora Eğitim Ortaklığı (MR/K501293/1), İngiltere Rejeneratif Tıp Platformu (MRC MR/L022974/1 ve MR/K026666/1), Baş Bilim İnsanı Ofisi (TCS/16/37) ödülleri ile desteklendi.
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |