الصب الوعائي لرئتي فأرة ما بعد الولادة المبكرة للتصوير المقطعي المجهري
Summary
والهدف من هذه التقنية هو تصور الجسم الحي السابق لشبكات الشرايين الرئوية للفئران المبكرة بعد الولادة والفئران البالغة من خلال تضخم الرئة وحقن مركب قائم على البوليمرات غير الشفافة لاسلكيًا عبر الشريان الرئوي. كما تناقش التطبيقات المحتملة للأنسجة المصبوبة.
Abstract
تشكل الأوعية الدموية شبكات معقدة في الفضاء ثلاثي الأبعاد. وبالتالي، من الصعب أن نقدر بصريا كيف تتفاعل الشبكات الوعائية والتصرف من خلال مراقبة سطح الأنسجة. توفر هذه الطريقة وسيلة لتصور بنية الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد المعقدة للرئة.
لتحقيق ذلك، يتم إدخال قسطرة في الشريان الرئوي ويتم في وقت واحد مسح الأوعية الدموية من الدم ومتوسع كيميائيا للحد من المقاومة. ثم يتم تضخيم الرئتين من خلال القصبة الهوائية في ضغط قياسي ويتم غرس مركب البوليمر في سرير الأوعية الدموية بمعدل تدفق قياسي. بمجرد ملء الشبكة الشريانية بأكملها والسماح للعلاج ، يمكن تصور الأوعية الدموية الرئة مباشرة أو صورة على ماسح ضوئي ميكرو CT (μCT).
عند تنفيذها بنجاح، يمكن للمرء أن نقدر شبكة الشرايين الرئوية في الفئران تتراوح بين أوائل سن ما بعد الولادة للبالغين. بالإضافة إلى ذلك، في حين أظهرت في السرير الشرياني الرئوي، يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي سرير الأوعية الدموية مع وضع القسطرة الأمثل ونقاط النهاية.
Introduction
التركيز من هذه التقنية هو تصور بنية الشرايين الرئوية باستخدام مركب البوليمر القائم في الفئران. في حين تم تنفيذ أعمال واسعة النطاق على الأسرة الأوعية الدموية الجهازية مثل الدماغ والقلب والكلى1،2،3،4،5، تتوفر معلومات أقل فيما يتعلق بإعداد وملء شبكة الشرايين الرئوية. الهدف من هذه الدراسة، لذلك، هو التوسع في العمل السابق6،,7،,8 وتقديم مرجع مفصل مكتوب وبصري يمكن للمحققين متابعته بسهولة لإنتاج صور عالية الدقة لشجرة الشرايين الرئوية.
في حين توجد العديد من الطرق لوضع العلامات وتصوير الأوعية الدموية الرئة, مثل التصوير بالرنين المغناطيسي, صدى القلب, أو CT angiography9,10, العديد من هذه الطرائق تفشل في ملء و / أو التقاط الأوعية الصغيرة بشكل كاف, الحد من نطاق ما يمكن دراسته. توفر أساليب مثل اقسام المسلسل وإعادة الاعمار دقة عالية ولكن الوقت / العمالة الكثيفة11،12،13. سلامة الأنسجة اللينة المحيطة للخطر في صب التآكل التقليدية10،13،14،15،16. حتى عمر الحيوان وحجمه يصبحان عاملين عند محاولة إدخال قسطرة أو عدم وجود القرار. تقنية حقن البوليمر، من ناحية أخرى، يملأ الشرايين إلى مستوى الشعيرات الدموية وعندما يقترن μCT، ويسمح لقرار لا مثيل لها5. وقد تم بنجاح إلقاء عينات من الرئتين الماوس لا تتجاوز سن 14 يوم بعد الولادةومعالجتها في غضون ساعات. ويمكن إعادة النظر في هذه إلى أجل غير مسمى، أو حتى إرسالها لإعداد الأنسجة النسيجية / المجهر الإلكتروني (EM) دون المساس الأنسجة الرخوة الموجودة17. القيود الرئيسية لهذا الأسلوب هي التكلفة مقدما من معدات / برامج CT، والتحديات مع مراقبة بدقة الضغط داخل الأوعية الدموية، وعدم القدرة على الحصول على البيانات طوليا في نفس الحيوان.
هذه الورقة يبني على العمل القائم لتحسين تقنية حقن الشريان الرئوي ودفع العمر / حجم الحدود ذات الصلة وصولا الى اليوم بعد الولادة 1 (P1) لتحقيق نتائج مذهلة. وهو مفيد للغاية للفرق التي ترغب في دراسة شبكات الأوعية الدموية الشريانية. وبناءً على ذلك، فإننا نقدم إرشادات جديدة لوضع القسطرة/تثبيتها، وزيادة التحكم في معدل التعبئة/الحجم، وتسليط الضوء على المزالق البارزة لزيادة نجاح الصب. ثم يمكن استخدام اللقيم الناتجة عن ذلك في التوصيف والتحليل المورفولوجي في المستقبل. ولعل الأهم من ذلك، أن هذا هو أول مظاهرة بصرية، على حد علمنا، التي تسير في المستخدم من خلال هذا الإجراء المعقد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تنفيذ هذه الطريقة بشكل صحيح ، وتسفر عن صور مذهلة لشبكات الشرايين الرئوية ، مما يسمح بالمقارنة والتجريب في نماذج القوارض. العديد من الخطوات الحاسمة على طول الطريق ضمان النجاح. أولاً، يجب على المحققين تهشيع الحيوان في المرحلة التحضيرية لمنع جلطات الدم من التشكل في الأوعية الدموية الرئو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج البحوث داخل الثقافات (DIR HL-006247). نود أن نشكر مرفق التصوير بالماوس NIH على التوجيه في الحصول على الصور وتحليلها.
Materials
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma – Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | SkyScan | 1172 | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B – MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
References
- Vasquez, S. X., et al. Optimization of microCT imaging and blood vessel diameter quantitation of preclinical specimen vasculature with radiopaque polymer injection medium. PLoS One. 6 (4), 19099 (2011).
- Hong, S. H., et al. Development of barium-based low viscosity contrast agents for micro CT vascular casting: Application to 3D visualization of the adult mouse cerebrovasculature. Journal of Neuroscience Research. 98 (2), 312-324 (2019).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3740 (2012).
- Zhang, H., Faber, J. E. De-novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2(+) bone marrow cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 87, 4-16 (2015).
- Kim, B. G., et al. CXCL12-CXCR4 signalling plays an essential role in proper patterning of aortic arch and pulmonary arteries. Cardiovascular Research. 113 (13), 1677-1687 (2017).
- Counter, W. B., Wang, I. Q., Farncombe, T. H., Labiris, N. R. Airway and pulmonary vascular measurements using contrast-enhanced micro-CT in rodents. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (12), 831-843 (2013).
- Phillips, M. R., et al. A method for evaluating the murine pulmonary vasculature using micro-computed tomography. Journal of Surgical Research. 207, 115-122 (2017).
- Schuster, D. P., Kovacs, A., Garbow, J., Piwnica-Worms, D. Recent advances in imaging the lungs of intact small animals. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 30 (2), 129-138 (2004).
- Samarage, C. R., et al. Technical Note: Contrast free angiography of the pulmonary vasculature in live mice using a laboratory x-ray source. Medical Physics. 43 (11), 6017 (2016).
- Grothausmann, R., Knudsen, L., Ochs, M., Muhlfeld, C. Digital 3D reconstructions using histological serial sections of lung tissue including the alveolar capillary network. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (2), 243-257 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Bussolati, G., Marchio, C., Volante, M. Tissue arrays as fiducial markers for section alignment in 3-D reconstruction technology. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (2), 438-445 (2005).
- Preissner, M., et al. Application of a novel in vivo imaging approach to measure pulmonary vascular responses in mice. Physiological Reports. 6 (19), 13875 (2018).
- Junaid, T. O., Bradley, R. S., Lewis, R. M., Aplin, J. D., Johnstone, E. D. Whole organ vascular casting and microCT examination of the human placental vascular tree reveals novel alterations associated with pregnancy disease. Scientific Reports. 7 (1), 4144 (2017).
- Bolender, R. P., Hyde, D. M., Dehoff, R. T. Lung morphometry: a new generation of tools and experiments for organ, tissue, cell, and molecular biology. American Journal of Physiology. 265 (6), 521-548 (1993).
- Savai, R., et al. Evaluation of angiogenesis using micro-computed tomography in a xenograft mouse model of lung cancer. Neoplasia. 11 (1), 48-56 (2009).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. American Journal of Pathology. 184 (2), 431-441 (2014).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. Journal of Surgical Research. 184 (1), 365-373 (2013).
- Zhang, H., Jin, B., Faber, J. E. Mouse models of Alzheimer’s disease cause rarefaction of pial collaterals and increased severity of ischemic stroke. Angiogenesis. 22 (2), 263-279 (2019).
- Faight, E. M., et al. MicroCT analysis of vascular morphometry: a comparison of right lung lobes in the SUGEN/hypoxic rat model of pulmonary arterial hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (2), 522-530 (2017).
- Fisher, S., Burgess, W. L., Hines, K. D., Mason, G. L., Owiny, J. R. Interstrain Differences in CO2-Induced Pulmonary Hemorrhage in Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (6), 811-815 (2016).
- Munce, N. R., et al. Intravascular and extravascular microvessel formation in chronic total occlusions a micro-CT imaging study. JACC Cardiovascular Imaging. 3 (8), 797-805 (2010).
- Shifren, A., Durmowicz, A. G., Knutsen, R. H., Faury, G., Mecham, R. P. Elastin insufficiency predisposes to elevated pulmonary circulatory pressures through changes in elastic artery structure. Journal of Applied Physiology. 105 (5), 1610-1619 (2008).
- Sonobe, T., et al. Imaging of the closed-chest mouse pulmonary circulation using synchrotron radiation microangiography. Journal of Applied Physiology (1985). 111 (1), 75-80 (2011).
- Ritman, E. L. Micro-computed tomography of the lungs and pulmonary-vascular system. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (6), 477-480 (2005).
- Dinkel, J., et al. Intrinsic gating for small-animal computed tomography: a robust ECG-less paradigm for deriving cardiac phase information and functional imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 235-243 (2008).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Ford, N. L., Thornton, M. M., Holdsworth, D. W. Fundamental image quality limits for microcomputed tomography in small animals. Medical Physics. 30 (11), 2869-2877 (2003).
- Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Molecular Imaging. 3 (3), 149-158 (2004).
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts–standard method for studying microvessels. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 48 (3), 257-261 (2007).
- Polguj, M., et al. Quality and quantity comparison study of corrosion casts of bovine testis made using two synthetic kits: Plastogen G and Batson no 17. Folia Morphologica (Warsz). 78 (3), 487-493 (2019).
- Verli, F. D., Rossi-Schneider, T. R., Schneider, F. L., Yurgel, L. S., de Souza, M. A. Vascular corrosion casting technique steps. Scanning. 29 (3), 128-132 (2007).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Albers, J., Markus, M. A., Alves, F., Dullin, C. X-ray based virtual histology allows guided sectioning of heavy ion stained murine lungs for histological analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7712 (2018).
- Katsamenis, O. L., et al. X-ray Micro-Computed Tomography for Nondestructive Three-Dimensional (3D) X-ray Histology. American Journal of Pathology. 189 (8), 1608-1620 (2019).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Wen, H., et al. Correlative Detection of Isolated Single and Multi-Cellular Calcifications in the Internal Elastic Lamina of Human Coronary Artery Samples. Scientific Reports. 8 (1), 10978 (2018).
- Zamir, A., et al. Robust phase retrieval for high resolution edge illumination x-ray phase-contrast computed tomography in non-ideal environments. Scientific Reports. 6, 31197 (2016).
- Yu, B., et al. Evaluation of phase retrieval approaches in magnified X-ray phase nano computerized tomography applied to bone tissue. Optics Express. 26 (9), 11110-11124 (2018).
- Bidola, P., et al. Application of sensitive, high-resolution imaging at a commercial lab-based X-ray micro-CT system using propagation-based phase retrieval. Journal of Microscopy. 266 (2), 211-220 (2017).
- Norvik, C., et al. Synchrotron-based phase-contrast micro-CT as a tool for understanding pulmonary vascular pathobiology and the 3-D microanatomy of alveolar capillary dysplasia. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (1), 65-75 (2020).
- Weibel, E. R. Lung morphometry: the link between structure and function. Cell and Tissue Research. 367 (3), 413-426 (2017).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Sarhaddi, D., et al. Validation of Histologic Bone Analysis Following Microfil Vessel Perfusion. Journal of Histotechnology. 35 (4), 180-183 (2012).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
