Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation

Mahlet  Z. Tamirat; Kari  J. Kurppa; Klaus Elenius; Mark  S. Johnson

doi:10.3791/61125

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

EGFR Somatik Mutasyonları Moleküler Dinamik Simülasyonu ile Aktive Etmenin Yapısal Etkilerinin Deşifre Edilmesi

Published: May 20, 2020

doi:

10.3791/61125

Mahlet Z. Tamirat¹, Kari J. Kurppa², Klaus Elenius^2,3,4, Mark S. Johnson¹

¹Structural Bioinformatics Laboratory, Biochemistry, Faculty of Science and Engineering,Åbo Akademi University, ²Medicity Research Laboratories and Institute of Biomedicine,University of Turku, ³Turku Bioscience Centre,University of Turku and Åbo Akademi University, ⁴Department of Oncology and Radiotherapy,University of Turku and Turku University Hospital

Summary

Bu protokolün amacı, EGFR kinazproteininin aktive mutasyonları nedeniyle meydana gelen dinamik yapısal değişiklikleri incelemek için moleküler dinamik simülasyonları kullanmaktır.

Abstract

Reseptör tirozin kinazlarının (RTK) epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ailesinde (ErbB) meydana gelen çok sayıda somatik mutasyon kanser hastalarından bildirilmiştir, ancak nispeten az sayıda test edilmiş ve ErbBs fonksiyonel değişikliklere neden olduğu gösterilmiştir. ErbB reseptörleri ligand bağlanması üzerine küçültülür ve aktive edilir ve reseptörlerin dinamik konformasyonel değişiklikleri aşağı sinyalin indüksiyonu için doğaldır. EGFR fonksiyonunu değiştirmek için deneysel olarak gösterilen iki mutasyon için, A702V ve Δ⁷⁴⁶ELREA⁷⁵⁰ silme mutasyonu, moleküler dinamiklerin (MD) simülasyonlarının (1) mutant tirozin kinaz yapısının konformasyonel stabilitesini vahşi tip EGFR ile karşılaştırıldığında nasıl inceleyebildiğini aşağıdaki protokolde gösteriyoruz; (2) yapısal sonuçları ve konformasyonel geçişler ve gözlenen fonksiyonel değişikliklere ilişkileri; (3) mutasyonların bağlayıcı ATP’nin gücü ve aktif asimetrik dimer’deki kizaz etki alanları arasındaki bağlanma üzerindeki etkileri; ve (4) mutasyonların aktive enzimle ilişkili EGFR bağlama bölgesi içindeki anahtar etkileşimler üzerindeki etkileri. Protokol, yapısal dinamikleri ve biyolojik fonksiyonla ilişkiyi araştırmak için MD simülasyonları kullanarak protein yapılarının araştırılmasında daha genel olarak yararlı olabilecek ayrıntılı bir adım adım prosedürün yanı sıra kılavuzluk da sağlar.

Introduction

EGFR/ErbB1/HER1, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 ve ErbB4/HER4 olmak üzere dört üyeden oluşan tirozin kinazlarının (RTK) insan epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ailesi (ErbB) dört üyeden imal edin. ErbB reseptörleri hücre büyümesi ve çoğalması, farklılaşma, göç ve sağkalım^1,^,²gibi temel hücresel süreçleri düzenler ve böylece güçlü proto-onkogenlerdir. ErbB reseptörlerinin anormal aktivitesi, özellikle EGFR ve ErbB2, sık sık kanser terapötikleri için ErbB reseptörleri anahtar hedefleri yapma insan kanserleri ile ilişkili olmuştur²^,³.

ERBB genlerinin çeşitli somatik değişiklikler insan maligniteleri^{bildirilmiştir 3}^,⁴^,⁵. En iyi karakterize örnekler arasında küçük hücreli dışı akciğer kanserinde (NSCLC) EGFR kigaz etki alanında tekrarlayan, aktive nokta mutasyonları ve kısa kare deletions sayılabilir. Bu EGFR mutasyonları kanser büyümesinin temel itici lerini temsil eder ve kanser^{ilaçlarını}hedefleyen EGFR’ye duyarlılığı tahmin eder 6^,⁷^,⁸. Ancak, çoğu kanserde, EGFR’deki somatik mutasyonlar bu tekrarlayan “sıcak noktalar” dışında meydana gelir ve reseptörün 1210 kalıntı süresinin tamamına dağılır. Nitekim, EGFR primer dizi boyunca kalıntılar çoğu insan kanseri^mutasyonauğramış olduğu bulunmuştur 9 . Bununla birlikte, birkaç sıcak nokta dışında, kanserle ilişkili EGFR mutasyonlarının büyük çoğunluğunun işlevsel önemi bilinmemektedir.

ErbB’lerin monomerik yapısı büyük bir amino terminal hücre dışı etki alanından oluşur ve ardından hücre içi tirozin kinaz etki alanına ve hücre içi sinyal proteinleri için yerleştirme alanları içeren C-terminal kuyruk bölgesine giden tek bir transmembran sarlis takip eder. Ligand bağlama, hücre dışı etki alanında dramatik bir konformasyonel değişimi tetikler, bu da simetrik olarak birbirinin üzerinde çapraz olan ve aromatik/hidrofobik yüzeyleri ile etkileşime giren dimerizasyon kollarını açığa çıkararak reseptör dimerlerinin oluşumunu kolaylaştırır. Reseptör dimer oluşumu üzerine tirozin kinaz etki alanları asimetrik temas(Şekil 1),reseptör monomerlerin C-terminal kuyrukları fosforilat kinazların aktivasyonu ile sonuçlanan, ve daha sonra downstream sinyal aktivasyonu¹⁰^,¹¹.

Şekil 1: EGFR dimer yapısı. EGFR, hücre dışı etki alanları büyüme faktörlerini (EGF, epidermal büyüme faktörü) bağladığında dimerizeeder. Alıcı kinaz etki alanı daha sonra aktivatör kinaz etki alanı ile asimetrik etkileşim yoluyla aktive edilir ve C-terminal kuyrukları tirozin artıklarında otofosforile edilir (Tamirat ve ark.^12’dendeğiştirilmiştir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Monomer dimer geçişleri sırasında meydana gelen dinamik yapısal yeniden düzenlemeler nedeniyle, asimetrik dimer oluşumu ile ilişkili kinizas aktivasyonu ile birlikte, reseptör yapısının tam uzunluğu boyunca mutasyonlar potansiyel reseptör fonksiyonu üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Burada mutasyon ve görüntülemenin modellenmesinin işlevin sonuçlarını açıklamak için yeterli olduğu önceki çalışmalarımızdan birkaç örnek açıklıyoruz.

Örnek 1: Bildirilen mutasyonlardan biri, ErbB4^13’teD595V , ErbB4 dimerizasyon ve fosforilasyonun artmasına yol açmıştır¹⁴. Mutasyonun yerinin görüntülenmesi gözlenen fonksiyonel etkileri anlamada kritik bir faktördü: D595V ektoetkimin dimerik kollarının simetrik kesişmesinde meydana gelmiştir(Şekil 2A). Kollar büyük ölçüde aromatik ve hidrofobik, ve valine tarafından kutup aspartik asit yerine “yapışkan” hidrofobik etkileşimleri artırmak için beklenebilir, dimer stabilize ve dolayısıyla fosforilasyon yer aldığında zaman süresini artırmak¹⁴. İlk başta her kolda aspartat bulmak için bir sürpriz oldu, ama geriye bakıldığında bir aktivite için bir zamanlama mekanizması olarak düşünebilirsiniz, polar asit yan zincirleri bozulmamış dimer yakınlık ve yaşam süresini azaltmak ve dolayısıyla kizim aracılı fosforilasyon ve sinyalizasyon sınırlamak nerede. Valine tarafından değiştirilmesi daha sonra daha erbB4 dimer stabilize ederek bu koruma kaldıracağını.

Şekil 2: Kiaz-ölü ErbB4 üreten mutasyon ve mutasyonları aktive eden bir ErbB4’ün yeri. (A) D595 (D595V mutasyonu aktive) ErbB4 ektodomain modelinin aromatik / hidrofobik dimerik kollarında yer alır; büyüme faktörü bağlama silah ilişkilendirmek; (yakındaki kalıntılar çubuk olarak gösterilir). (B) ErbB4’te, G802 (G802dup mutasyonunu devre dışı katarak) ATP’nin adenin halkası ve katalitik D861 (d861Y mutasyonunu devre dışı) etrafında ki bağlama cebinin oluşmasına yardımcı olur ve hem Mg²⁺ (gösterilmez) hem de γ fosfat grubunu bağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Örnek 2: Kiaz etki alanının ATP bağlayıcı bölgesini hedef alan somatik mutasyonların sinyalizasyonu ndan aciz bir bozulmuş veya kiyer-ölü reseptöre yol açan enzimatik aktiviteyi değiştireceği veya ortadan kaldıracağı tahmin edilebilir. Meme, gastrik, kolorektal veya NSCLC¹⁵hastalarından bildirilen dokuz mutasyondan ikisi, test edildiğinde yüksek oranda azalmış fosforilasyon aktivitesi¹⁶: G802dup (G → GG) ve D861Y. Tirozin kinaz etki alanı yapısının ATP bağlama bölgesinde(Şekil 2B):esnek glisin, çoğaltılmış, adenin halka bölgesini değiştirir ve terminal fosfatların yakınındaki hantal tirozin ile değiştirilen küçük aspartik asit mg²⁺-ATP’nin bağlanmasını fiziksel olarak önler. Ancak, ErbB4 ErbB2 ile heterodimer oluşturabilirsiniz beri – ErbB2 bir büyüme faktörü bağlamaz ve heterodimerize için yapar bir ErbB ile ilişkibağlıdır – ErbB2(aktif)-ErbB4 (kinaaz-ölü) heterodimer Erk / Akt sinyal yolu ile hücre çoğalmasını teşvik edecek henüz hücreler kiaz-ölü ErbB4 ve STAT5 yol aktivasyon eksikliği nedeniyle ayırt olmaz¹⁶.

Daha yakın tarihli çalışmalarda, ErbB’lerin dinamik hareketlerinin bazı mutantların ErbB fonksiyonu, özellikle tirozin kinaz etki alanı içinde meydana gelen mutasyonlar üzerindeki etkilerini anlamak için önemli olduğu ortaya çıkmıştır. Tirozin kinaz etki alanı bir N-lob oluşur (özellikle β-levhalar) ve C-lob (büyük ölçüde alfa sarmal), ATP bağlanır katalitik site ile ayrılır. N-lobe αC helis ve P-loop içerir, aktivasyon ise (A-loop) ve katalitik döngüler C-lob^{mevcuttur 17}^,¹⁸^,¹⁹. Tirozin kinaz etki alanının kristal yapıları iki inaktif konformasyon ortaya, yapıların çoğunluğu Src benzeri inaktif duruma sahip. Aktif konformasyonda A-loop noktalarının ATP bağlama bölgesine doğru katalitik aspartat ve αC sarlis ATP bağlama cebine (“αC-in” konformasyonu) doğru yönlendirilir ve güçlü bir glutamat-lizin-ion çifti etkileşimi oluşturur.

ErbB’ler ve bileşen kiazaz etki alanı son derece dinamik varlıklar olduğundan ve özellikle mutasyonların fonksiyon ve biyolojik aktivite üzerindeki etkilerinin ErbB’lerin konformasyonel durumlarıyla sıkı bir şekilde bağlantılı olduğu durumlarda, mutasyonların yaşayacakları dinamik değişikliklerin aralığına göre değerlendirilmesi önemlidir. ErbB’lerin X-ışını kristal yapıları, mutasyonun dinamik sonuçlarını anlamakla ilgili olabilecek veya olmayan 3B yapısının statik anlık görüntülerini sağlar. Üç boyutlu (3D) bir yapıya sahip “enerji manzarasına” karşılık gelen dinamik değişikliklerin aralığını araştırmak için moleküler dinamikler (MD) simülasyonları yaygın olarak²⁰olarak kullanılmaktadır. Tirozin kinaz etki alanı içinde lokal konformasyonel değişikliklere yol açacak mutasyonlar veya bir kompleksin stabilizasyonu durumunda, 100 ns sırasına göre simülasyonlar yeterli olabilir. Ancak, daha büyük ölçekli konformasyonel değişiklikler (örneğin, kizaz etki alanının aktif ve etkin olmayan konformasyonları arasındaki geçişler) daha uzun bir simülasyon süresi gerektirir – mikrosaniye sırasına göre²¹.

Aşağıda açıklanan protokole göre tirozin kinaz etki alanı içinde iki aktive mutasyonu göz önünde bulundururuz(Şekil 3). Her iki mutasyon da kizazın aktif olup olmadığını belirleyen lokal konformasyonel değişiklikler yaşayan konumlarda kizaz etki alanı içinde yer alır ve bu nedenle her iki durumda da MD simülasyonları uygulanır. İlk durumda, doğrudan ATP bağlama sitesi ve EGFR alıcı kiyaz etki alanının katalitik makine etkileyen değişiklikleri düşünün, özellikle yaygın NSCLC⁴karıştığı bir exon 19 silme mutasyonunun sonuçlarını inceleyerek^,⁷. Δ⁷⁴⁶ELREA⁷⁵⁰ mutasyonu, αC sarikten önceki β3-αC döngünün uzunluğunu azaltır – kinaz aktivasyonundaki bağlayıcı/aktif bölgeye doğru hareket eden ve ATP ile etkileşim için lizini konumlandırarak helis ile K745 arasındaki kritik elektrostatik etkileşimin oluşturulmasına katılan sarilik – aktivasyon için etki alanını^12. İkinci olguda, egfr A702V mutasyonu düşünün, yeni bir kazanç-fonksiyon aktive mutasyon iScream platformu^tarafından ortaya 9 ve bir NSCLC hasta da tanımlanan²². Alanine-702 alıcı kizaz etki alanı üzerinde alıcı ve aktivatör kinaz etki arayüzünde yan yana segment B yer almaktadır, hangi bu asimetrik kiaz azmin kompleksi ve kiyaz konformasyonel değişiklikler aktivasyon için gereklidir⁹.

Şekil 3: EGFR asimetrik kinaz etki dimer. A702V mutasyonu aktivatör ve alıcı kinasan etki alanlarının kritik arayüzünde, αC sarlisine bitişik ve aktivatör kisenini izolucine 941’e yakın bir yerde yer alır. Asimetrik dimer oluşumu ile indüklenen konformasyonel değişiklikler kinaz aktivasyonuna yol açar. ELREA dizisini içeren β3-αC döngüsü αC sariktan hemen önce gelir; aktivasyon sırasında αC sarlis ivediye doğru ATP bağlama bölgesine doğru ilerler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

NOT: ΔELREA ve A702V mutasyonunun MD simülasyonları kullanılarak EGFR yapısı üzerindeki etkilerini incelemek için atılan ayrıntılı adımlar aşağıdaki gibi tartışılmıştır: 1. Yapı hazırlığı NOT: ΔELREA mutasyonunun yapısal etkilerini incelemek amacıyla, apo aktif, ATP’ye bağlı aktif ve apo inaktif EGFR monomer yapıların yabani tipi ve mutant formları aşağıdaki gibi hazırlanır. Yabani tip apo aktif EGFR kigaz yapısını hazırlamak için Chimera23 görselleştirme programını(https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/)açın. Dosya menüsünde ID’ye göre Getir seçeneğini tıklayın ve Protein Veri Bankası (PDB24)veritabanını seçin ve PDB kodu 2GS225 (2,8 şçözünürlük) belirtin. PDB, X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi, kriyo-elektron mikroskobu ve nötron kırınımı gibi farklı deneysel tekniklerle çözülen 3Boyutlu yapılar için bir depodur. EGFR PDB yapıları 1M1426 (2.6 Å) ve 3W2S27 (1.9 Å) bu segmentleri alarak 2GS2 eksik yapısal elemanları oluşturun. Bunu yapmak için, 1M14 ve 3W2S’yi açın ve Araçlar → Yapısı karşılaştırma menüsündeki ÇöpÇatan seçeneğini kullanarak 2GS2’ye ekleyin. 1M14 ve 3W2S’den eklenecek segmentleri kırpın. 2GS2’deki boşluklardan önce kalıntının terminal atomlarını ve 1M14 ve 3W2S’den eklenecek atomları seçin (eklenen segmentler hakkında ayrıntılı bilgi için Tablo 1’ebakın). Komut satırında tip bağ sel ve vurmak girin. Bu yapı şablon yapısıdır. EGFR kigaz etki alanının ΔELREA silme mutant formunu oluşturmak için adım 1.2’deki şablon yapısını kullanın. ΔELREA EGFR’nin FASTA format dizisini şablon yapısının sırasını kaydederek(Favori → Dizisi → Dosyası → kaydedin)ve ardından ELREA dizisini 746-750 kalıntı numaralarıyla silerek üretin. ΔELREA EGFR sırasını Chimera’da açın ve Sıra menüsünü kullanarak 2GS2 şablon yapısının dizilimi ile hizala. Hizalama penceresinde Model Yapısı (homoloji)28 seçeneğini →. Açılan pencerede 2GS2 bileşik yapısını şablon olarak ve mutant sırasını modellenecek sorgu olarak belirtin. Sonra Tamam tuşunabasın. ZDOPE skoru (genellikle en düşük puan) ve görsel denetimdayalı, ortaya çıkan modeller arasında bir mutant modeli seçin. ATP’ye bağlı yabani tip EGFR kizaz yapısını hazırlamak için pdb yapısını 2ITX29 (2,98 Å) ana yapı olarak kullanın. Adım 1.2’deki yordamı izleyen 2GS625 (2.6 Å) ve 3W2S yapılarını kullanarak eksik segmentler oluşturun (bkz. Tablo 1). PDB dosyasını bir metin düzenleyicisinde açarak ve ANP’nin N3B azot atomuna oksijen atomuna dönüştürerek, elde edilen yapıdaki ligand ANP’yi ATP’ye dönüştürün. 1.1.’de belirtildiği gibi Chimera’da 1.4. Mg 2+ iyonu için benzer bir konumlandırma elde etmek için PDB yapısı 2ITN29 (2.47 Å) bu yapıya magnezyum iyonu ekleyin. 1.5 adımdan kaynaklanan yapı ile ΔELREA mutant formunu 1.3 adımdan takip ederek modellendirin. Apo aktif EGFR Apo inaktif EGFR ATP’ye bağlı aktif EGFR Temel yapı 2GS2 2GS7 2ITX Eksik döngüler oluşturmak için kullanılan yapılar 1M14 (723-725) 3W2S (958-984) 2GS6 (862-865) 3W2S (967-981) 4HJO (848-850) 3W2S (990-1001) Tablo 1: Apo aktif, apo etkin olmayan ve ATP’ye bağlı aktif yapıların kompozit modellerini oluşturmak için kullanılan yapılar. Ana yapıdaki eksik bölgeler (parantez içinde amino asit aralığı) listelenen yapılardan inşa edilmiştir. Yabani tip apo inaktif EGFR kizaz yapısını hazırlamak için, 1.1 adımda olduğu gibi PDB yapısını 2GS725 (2.6 Å) açın ve bağlı ligandları ve kristalografik suları silin. Adım 1.2’deki yordamı kullanarak 3W2S ve 4HJO30 (2,75 Å) yapılarından 2GS7’deki eksik segmentleri (bkz. Tablo 1’ebakınız) ekleyin. Son inaktif EGFR yapısına dayanarak, adım 1.3 prosedürü kullanarak mutant modeli hazırlamak.NOT: A702V mutasyon çalışması için, mutasyon dimer arabiriminin büyük bir bölümünü oluşturan kizaz etki alanının yan yana b segmentinde yer alması nedeniyle EGFR asimetrik dimer yapısı incelenmiştir. Yabani tip ve A702V mutant EGFR yapıları aşağıdaki gibi hazırlanır: Yabani tip asimetrik dimer yapısı PDB yapısı 2GS2,başlangıçta monomerik formda görüntülenir inşa edilmiştir. Asimetrik düzenlemede aktivatör ve alıcı kinazlarını içeren biyolojik montaja dönüştürmek için Chimera’da (1.1) olduğu gibi 2GS2’yi açın ve Üst Düzey Yapı → Birim Hücre menüsünden araçlar→tıklayarak simetri hesaplamaları yapın. 2GS2 yapısını seçin ve kopya yap’ıgirin. Son olarak, simetri işlemlerinden kaynaklanan dimer’ın birden çok kopyasından tek bir asimetrik dimer seçin ve kaydedin. 1.8 adımdan itibaren vahşi tip asimetrik EGFR yapısını kullanarak, Chimera’daki Rotamers seçeneği→ Araçlar → Yapısı düzenlemesini kullanarak alanin 702’yi valine değiştirerek A702V mutantını oluşturun.NOT: ΔELREA ve A702V mutasyon çalışmaları için toplu olarak altı monomerik ve iki dimerik EGFR yapısı hazırlanmıştır. Her yapı daha sonra Maestro programı31 protein hazırlama sihirbazı kullanılarak simülasyon için işlenir ve MD simülasyonları Amber programı32ile yapılır. Dosya → alma yapısı seçeneğini kullanarak Maestro’daki yapıyı açın. Daha sonra protein hazırlama sihirbazı düğmesine tıklayın ve aşağıdakileri seçin: hidrojen atomları ekleyin, eksik yan zincir atomları oluşturmak, PROPKA kullanarak pH 7.0 iyonizable kalıntıların protonasyon durumlarını belirlemek, hidrojen yapıştırma için asparagin, glutamin ve histidin kalıntıları yönünü optimize, ve nihayet yapıyı en aza indirmek. 2. Sistem kurulumu Amber yazılım paketinde yer alan artık programını açın. İthalat ff14SB kuvvet alanı33 (kaynak leaprc.protein.ff14SB) ve TIP3P su molekülleri34 (kaynak leaprc.water.tip3p). ATP’ye bağlı sistemler için de ATP35 (loadamberparams frcmod.phosphate, loadamberprep ATP.prep)için parametreler imal edilir. Daha sonra, yapıyı yükleyin (mol = loadpdb structure.pdb). Proteinin yüzey atomlarından 10 Å’ı her yöne uzanan açık TIP3P su molekülleriyle bir sekizahedral kutudaki yapıyı çözündürün(solvateoct mol TIP3PBOX 10.0). Yapılı sistemi kontrol edin (Mol’u kontrol edin)ve gerekli iyonlar ekleyerek nötralizeedin (mol Na+ 0 addions). Biyomoleküler sistemleri yeterince modellemek için, sistem tuz konsantrasyonunu 0,15 M’e(addions mol Na+ X, addions mol Cl- X)getirmek için simülasyon kutusuna ek Na+/Cl- atomları ekleyin, x’in yerini x’in aldığı yer: istenilen tuz konsantrasyonu * su molekülü başına hacim * Avogadro’nun sayısı. Oluşturmak ve sonraki üretim simülasyonu için girdi olarak hizmet sistemin topoloji ve koordinat dosyaları kaydetmek(saveamberparm mol X.prmtop X.inpcrd). 3. Moleküler dinamik simülasyonu Amber kullanarak, başlangıçta en dik iniş 5000 döngüleri için simülasyon sistemi tabi ve olumsuz yapılandırmaları atlatmak için gradyan enerji en aza indirilmesi eşleşin. Solute atomlara uygulanan kısıtlamayı 25 kcal mol-1 ş-2 ila 0 kcal mol-1 ş-2’denkademeli olarak indirerek birden fazla adımda en aza indirin. En küçük leştirme giriş dosyasında, min.in,toplam en küçükleştirme döngüsü (maxcyc = 5000) ve ncyc için en dik iniş algoritması için döngü sayısını belirtmek için maxcyc değişkenini ayarlayın. Restraint_wt değişkenini kullanarak emniyet maskesi parametresi tarafından belirtilen solute atomlara bağlama kuvveti uygulayın. Sonra aşağıdaki gibi en aza iner:$AMBERHOME/bin/zımpara -O -i min.in -o min.out -p X.prmtop -c X.inpcrd -r min.rst -ref X.inpcrdNOT: Kullanılan strateji ve gerçek parametreler kişinin kendi tercihlerine göre değişiklik gösterebilir. Ayrıntılar ve rehberlik Amber kılavuzu ve web sitesinden bulunabilir (https://ambermd.org/index.php) Sistemi 0 K’dan 300 K’ye kadar 10 0 0 0 0 000 ps’lik bir ısı ile 10 kcal mol-1 ş-2 solute atomlar üzerinde dizginleme ayar. Bunu yapmak için tempi = 0,0, temp0 = 300.0, dt = 0.002 ps, nstlim = 50000 ve restraint_wt = 10 heat.in giriş dosyasında ayarlayın. Isıtma’yı aşağıdaki komutla gerçekleştirin:$AMBERHOME/bin/zımpara -O -i heat.in -o heat.out -p X.prmtop -c min.rst -r heat.rst -x heat.mdcrd -ref min.rst Bir NPT topluluğu altında 900 ps için sistem dengeleyin; sabit sayıda atom, sıcaklık (temp0 = 300.0) ve basınç (ntp = 1), Berendsen yöntemi ile kontrol (ntt = 1). Uzun menzilli elektrostatik etkileşimler için 9 şmesafe kesme(kesme = 9,0)ayarlayın. Solute atom kısıtlamasını kademeli olarak 0,1 kcal mol-1 ş-2 (restraint_wt = 0,1’edüşürün). Yukarıdaki parametreleri aşağıdaki gibi açıklayan equil.in denklik giriş dosyasını çalıştırın:$AMBERHOME/bin/zımpara -O -i equil.in -o equil.out -p X.prmtop -c heat.rst -r equil.rst -x equil.mdcrd -ref heat.rst Sınırsız 5 ns simülasyonu ile dengeyi kesinleştirin (dt = 0.002 ps, ntslim = 2500000).$AMBERHOME/bin/zımpara -O -i equil_final.in -o equil_final.out -p X.prmtop -c equil.rst -r equil_final.rst -x equil_final.mdcrd -ref equil.rst Sistemin sıcaklık, basınç, yoğunluk ve enerji değerlerini inceleyerek dengede olup olmadığını kontrol edin.$AMBERHOME/bin/process_mdout.perl ısı.dışarı equil.out equil_final.outxmgrace özeti. TEMP/YOĞUNLUK/ETOT/EPTOT/EKTOT 100 ns (set dt = 0.002 ps, ntslim = 50000000 prod.in)için üretim simülasyonu yürütmek ve her 10 ps(ntwx = 5000)konforkaydetmek.$AMBERHOME/bin/zımpara -O -i prod.in -o prod.out -p X.prmtop -c equil_final.rst -r prod.rst -x prod.mdrcd -ref equil_final.rst 4. Analiz Görsel denetim X.prmtop amber topoloji dosyalarını ve VMD36’dakiilgili prod.mdcrd yörünge dosyalarını açarak vahşi tip ve mutant EGFR kigaz simülasyonları sırasında örnekalınan konformasyonları görselleştirin. Uygun ikincil yapı gösterimlerini kullanarak, proteinlerin genel yapısal dinamiklerini kaydedilen yörüngeden analiz edin. Katalitik olarak gerekli olan K745 – E762 tuz köprüsü gibi atomlar/ilgi artıkları arasındaki belirli etkileşimleri görüntüleyin. Alternatif olarak, simülasyon sırasında alınan birden çok konformasyonu PDB formatında kaydedin ve Chimera programını kullanarak açın. MatchMaker seçeneğini kullanarak yapıları ilk veya ortanca yapıya üst üste bindirin. İlk/ortanca yapıyı katı, geri kalanını ise soluk beyaz olarak görüntüleyin. Bu yaklaşım, kaydedilen yapısal hareketleri daha net bir şekilde görselleştirmenizi sağlar.NOT: MDS’den konformasyonel toplulukların etkin temsilleri ve işlenmesi için öneriler Melvin ve ark.37’debulunabilir. RMSD ve RMSF analizi Proteinlerin küresel kararlılığını analiz etmek ve farklı yapısal birimlerin esnekliğini incelemek için Cpptraj programı38 ile kök ortalamakare sapma (RMSD) ve kök-ortalama kare dalgalanma (RMSF) hesaplamalarını hesaplat. rmsd.in ve rmsf.in giriş dosyalarında, rms montajı için referans olarak ilk yapının omurga atomlarını (RMSD için) ve Cα atomlarını (RMSF için) belirtin. rmsd/rmsf.in dosyaları kehribar topoloji dosyaları(parm X.promtop)ve ilgili yörünge dosyaları(trajin prod.mdcrd)almak. Sonra Cpptraj -i rmsd/rmsf.inkomutunu çalıştırın. Çıktı verilerini çözümleme için çizin. Alternatif olarak, konformasyonel toplulukları hizalayın ve her kalıntıyı Cα atomu RMSD’ye göre renklendirin. Bunu yapmak için Chimera’daki konformasyonları açın ve Çöpçatan seçeneğiyle hizalayın. Araçlara gidin → Tasvir → Render’a öznitelik. Öznitelikleri olarak konformasyonel topluluk ve Cα RMSD kalıntıları seçin ve Tamam’ıtıklatın. Konformasyonların zincir izi daha sonra mavi → beyaz → kırmızıdan renklendirilecek ve sırasıyla yüksek, orta ve düşük yapısal stabilite bölgelerini yansıtacaktır. Hidrojen bağı analizi ATP ile yabani tip/ΔELREA EGFR’ler arasındaki hidrojen bağı etkileşimini analiz edin. Bu görevi yerine getirmek için bir Cpptraj komut dosyası hazırlayın, hbond.in. 3,5 Å’tan daha az veya eşit donör kabul mesafesi ve 135°’den büyük veya eşit bir bağ açısına sahip bir hidrojen bağı tanımlayın. Sadece atp ve EGFR arasındaki nointramol değişkeni yani hidrojen bağları ile moleküler hidrojen bağları için analiz belirtin (hbond Tüm nointramol dist 3.5 dışarı nhb.agr avgout avghb.dat). Komut dosyasını Cpptraj -i hbond.inolarak çalıştırın. Örneğin EGFR kinaz aktivitesi için önemli kalıntılar olan K745 ve E762 artıkları arasındaki moleküler etkileşimleri değerlendirmek için bu komut dosyasını kullanın. Bunu yapmak için, hidrojen bağı donör ve E762 hidrojen bağı kabul olarak k745 belirtin hbond.in ve buna göre komut çalıştırın. Atomlar arasındaki mesafenin izlenmesi VMD’deyabani tip ve ΔELREA apo EGFR yörüngelerini açarak K745 ve E762 arasındaki mesafeyi ölçün. Mouse → etiketinetıklayarak Glu762’nin Cδ’sini ve Lys745’in Nz’sini →. Grafik → etiketleri → bağ → grafiğiile bir grafik çizerek simülasyon sırasında mesafeyi izleyin. Ücretsiz enerji hesaplamaları ATP ve yabani tip/ΔELREA EGFR’ler arasında ve yabani tip/A702V EGFR’lerin aktivatör ve alıcı kinazları arasında tahmini bağlayıcı serbest enerjileri hesaplamak için AMBER paketinde bulunan moleküler mekanik jeneralize edilmiş Doğal yüzey alanı (MM-GBSA) modül39’u kullanın. ΔELREA çalışmasında ATP’yi ligand ve EGFR reseptör olarak ayarlayın. A702V çalışmasında alıcı kiazını ligand, aktivatör kiazise reseptör olarak belirtiniz. İlk olarak, pbradii değerini mbondi2’yeayarlayan artık programında ligand, reseptör ve ligand-reseptör kompleksi PDB dosyalarını ayrı ayrı hazırlayın. PDB dosyaları için gaz fazı kehribar topolojisini (.prmtop) kaydedin ve (.inpcrd) dosyalarını koordine edin. Sonra, mmgbsa giriş dosyasında, mmgbsa.in, igb = 2 = 2 , saltcon = 0.1ayarlayın. Simülasyonların yörüngelerini, hazırlanan reseptör/ligand kehribar dosyalarını ve mmgbsa.in’daki parametreleri kullanarak bağlayıcı enerji hesaplamalarını Amber’da bulunan MMPBSA.py komut dosyası ile aşağıdaki şekilde gerçekleştirin:$AMBERHOME/bin/MMPBSA.py -O -i mmgbsa.in -o mmgbsa.dat -sp X.prmtop -cp complex.prmtop -rp receptor.prmtop -lp ligand.prmtop -y prod.mdcrd -eo output.csv Grafik çizerek çıktı verilerini, output.csv’yianaliz edin.

Representative Results

Açıklanan protokol, ΔELREA ve A702V mutasyonlarının EGFR kigaz yapısı üzerindeki yapısal etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Protokolün bir uygulaması, MUTASYONların MD simülasyonlarından RMSD ve RMSF değerlerini hesaplayarak lokal yapısal/konformasyonel stabilite üzerindeki etkisini araştırmaktı. A702V mutasyonu juxtamemembran B segmentinde yer alması nedeniyle, başlangıç yapısına göre alıcı kimyonun bu segmentinin RMSD’si hem yabani tip hem de A702V EGFR’ler için hesaplanmıştır. Sonuç (Şekil 4A)mutantın juxtramembran B segmentinin 100 ns simülasyonu sırasında konformasyonel stabiliteyi artırdığını ortaya koymuştur (ortalama RMSD 0.7 ş- güven aralığı (CI) 0.009) vahşi tip EGFR kiinase etki alanına göre (ortalama RMSD 1.1 ş- 95% CI 0.01). Bu büyük olasılıkla, alanin 702 ‘nin (metil grubu yan zincir) hantal hidrofobik kalıntıya ( izopropil grup yan zincir) değiştirilmesi nedeniyle dimer arayüzündeki daha sıkı hidrofobik etkileşimlerin sonucudur, bu da V702’nin alıcı kiyazı etki alanında aktivor kinaz etki alanının isoleucine 941 ile hidrofobik etkileşimlerinin artmasına yol açmaktadır. ΔELREA mutasyonu β3-αC döngüsünde, işlevsel olarak kritik αC sarkıkın bitişiğinde yer alır; αC sarlisinin konformasyonu, EGFR kisinin aktif ve inaktif durumları arasındaki kaymaların anahtarıdır. Aktif durumdaki αC helisin konformasyonel stabilitesi, MD simülasyonları sırasında sarkıkiçindeki Cα kalıntı atomları üzerinden RMSF inceleyerek değerlendirildi (Şekil 4B): genel olarak, mutantta daha düşük dalgalanmalar var (ortalama RMSF 1.1 ş- CI 0.4) vahşi tipe göre (ortalama RMSF 1.5 ş- CI 0.57); N-terminal artıkları için kaydedilen dalgalanmalar en yüksek fark ile. Yabani tip kiyaz etki alanının ve ΔELELA kiyaz etki alanının ortanca yapısına göre sıralanan örneklenmiş konformasyonlar da bu sonuçları destekler (Şekil 4C): hem yabani tip hem de ΔELREA kinizas etki alanları β3-αC döngüsü ve ΔELREAFR EG EG’de açıkça daha kararlı olan αC helix dışında süperpozasyon konstrüktasyonları için genel olarak benzer kararlılığa sahiptir. Bu bulgular, ELREA dizisinin silinmesinin aktif durum αC sarlisinin hareketini kısıtladığını, dolayısıyla aktif konformasyonu dizginlediğini ve böylece stabilize ettiğini göstermektedir. Ayrıca, αC saricisi asimetrik dimer arabiriminin bir parçasını oluşturduğundan, mutanttaki αC sarilsüzerindeki kısıtlamalar büyük olasılıkla asimetrik dimer’i stabilize ederek aktif halsüresini uzatır. Protokolün bir diğer uygulaması da simülasyon sırasında gerçekleşen anahtar intra-ve intermoleküler etkileşimlerin davranışını araştırmaktır. Böylece, EGFR enzimatik aktivitesinin temelini oluşturan K745 ve E762 arasındaki etkileşim, MD simülasyonları sırasında iki kalıntının yan zincirli polar atomları arasında oluşan hidrojen bağlarının yüzde doluluk yüzdesi ölçülerek hem aktif form yabani tip hem de ΔELREA EGFR kinazı için analiz edilmiştir (Şekil 5A): Bu anahtar elektrostatik etkileşim, E762’yi barındıran daha kararlı αC sarmalısayesinde δelrea kigaz etki alanında yabani tip kigaz etki alanına göre daha sık oluşmuştur. Simülasyon sırasında Mg2+-ATP ve yabani tip ve ΔELREA EGFR kizaz etki alanları(Şekil 5B)arasındaki etkileşimler de değerlendirildi (Şekil 5C): ΔELREA için hidrojen bağları sayısı (ortalama değer 4.0 – CI 0.03) yabani tip EGFR’den (ortalama değer 3.2 – CI 0.04) daha fazlaydı. Hidrojen bağlarının daha fazla analizi, K745’in ΔELREA mutant EGFR kigaz etki alanının simülasyonunda belirtilen daha kararlı K745-E762 etkileşimine bağlı olan ΔELREA EGFR’deki ATP fosfat gruplarıyla daha sık etkileşime girdiği ortaya çıktı. Protokolde açıklandığı gibi MD simülasyonları protein-protein ve protein-ligand etkileşimleri için bağlayıcı göreceli serbest enerji değerlendirilmesinde de yararlıdır. Vahşi tip ve A702V EGFR’lerin aktivatör ve alıcı kimyaz alanları ile ATP ile yabani tip ve ΔELREA mutant EGFR kiazaz etki alanları arasındaki bağlayıcı enerjiler, moleküler mekanik genelleştirilmiş Tarihi yüzey alanı (MMGBSA) hesaplamalarından hesaplanmış(Şekil 6A):A702V mutant daha düşük bir ortalama ΔGbağlama değeri (ortalama ΔGbağlama değeri –76 kcal/mol – 95% CI 0,47), yabani tip EGFR etki alanı (ortalama ΔG bind = -61calbind = -61cal/mol – 95% 61 01 01) aksine, daha olumlu dimer etkileşimleri temsil üretti. Bu gözlem, A702V EGFR kigaz etki alanı için gözlenen hidrofobik etkileşimlerin artması nedeniyle daha kararlı yan yana B segmenti ve daha sıkı dimer arabirimi ile tutarlıdır. YABANI tip ve ΔELREA EGFR kigaz etki alanları(Şekil 6B)için ATP bağlanması durumunda, MMGBSA hesaplamaları δelrea mutant (ortalama ΔGbağlama -57 kcal/mol – 95% CI 0,43) ile güçlü ATP bağlanması tahmin wild tipi EGFR (ortalama ΔGbind -48 kcal/mol – 95% CI 0.33). Bu sonuç, atp ve ΔELREA EGFR(Şekil 5C)arasında kaydedilen hidrojen bağlarının daha fazla sayıda vahşi tür etki alanına göre aynı doğrultudadır. Protokol, simülasyon sırasında gözlenen konformasyonel değişiklikleri araştırmak için de kullanılabilir. Mevcut çalışmada, ΔELREA mutasyonunun inaktif EGFR konformasyonu üzerindeki etkileri simülasyondan alınan örneklenmiş konformasyonların görsel inceleme ve süperkonumlanması ile incelenmiştir. Analiz, αC sarlisinin ΔELREA EGFR kigaz etki alanında(Şekil 7A)bir içe doğru hareketini ortaya çıkardı ve aktif duruma geçiş sırasında yapısal bir değişiklik bekleniyor. Buna karşılık, yabani tip inaktif EGFR αC sarlis ilk konformasyonunu korudu(Şekil 7B). Böylece, MD simülasyonları, kizaz aktivitesini artırmak için deneysel olarak gösterilen silme mutasyonu40,41,aktif duruma doğru inaktif kiziaz bir konformasyonel kayma teşvik önerisi destekler. Şekil 4: MD simülasyonları sırasında aktif EGFR kigaz etki alanının vahşi tip ve mutant konformasyonel stabilitesi. (A) RMSD (omurga atomları) yabani tip (mavi) ve A702V (kırmızı) alıcı kinas etki alanının yan yana B segmenti üzerinde. (B) ΑC sarisinin kalıntıları üzerinde RMSF (Cα atomları) : yabani tip (mavi) ve ΔELREA (altın). (C) Yabani tip (solda) ve ΔELREA (sağda) EGFR kigaz etki alanının süperpoze örneklenmiş konformasyonları; ortanca yapıya göre her kalıntının RMSD (Cα atomları) temel alınarak renkli zincir izleri. Boyama, maviden beyaza, kırmızıya, yüksek ve düşük konformasyonel kararlılık bölgelerini temsil eder. İzole edilen kizaz etki alanının “ücretsiz” N-terminal bölgelerinin, kırmızı renkli, bozulmamış EGFR yapısında bu düzeyde hareketlilik sergilemeyeceğine dikkat edin. Çakroborty ve ark.9’dan uyarlanan rakamlar (Şekil 4A Biyolojik Kimya Dergisi’ninizniyle çoğaltılmıştır) ve Tamirat ve ark.12. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: MD simülasyonları sırasında aktif alıcı kinde görülen temel özellikler: K745-E762 tuz köprüsü, αC sarlis ve ATP ile etkileşimler. (A) Yabani tip (mavi) ve ΔELREA (altın) EGFR kiazalan etki alanlarının simülasyonu sırasında K745-E762 etkileşiminin yüzde doluluk oranı. (B) ATP (sopa) ile etkileşime sahip yabani tip ve ΔELREA mutant kalıntıları. MG2+ (yeşil) ATP ve D855 ile koordinatları. (C) MD simülasyonları sırasında HEM yabani tip hem de ΔELREA EGFR kigaz etki alanları ile ATP tarafından oluşturulan hidrojen bağlarının sayısı. Tamirat ve ark.12’denşekil . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Simülasyonlar sırasında mutant kinaz etki alanları için daha düşük bağıl serbest bağlama enerjileri gözlenir. (A)Bağlama enerjileri, yabani tip (mavi) ve A702V (kırmızı) EGVR’lerin aktivatör ve alıcı kinasalan etki alanları arasındaki etkileşim için hesaplanır. (B) ΔG ATP’yi yabani tip (mavi) ve ΔELREA (altın) EGFR kigaz etki alanınabağlar. Çakroborty ve ark.9’dan uyarlanan rakamlar (Şekil 6A Biyolojik Kimya Dergisi’ninizniyle çoğaltılmıştır) ve Tamirat ve ark.12. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Yabani tip ve ΔELREA inaktif EGFR kigaz etki alanından süperpoze konformasyonlar. ΑC sarlis ve A-loop sarlisinin(A)yabani tipi (mavi ortanca yapı) ve (B) ΔELREA EGFR’lerinin (altın) konformasyonu. Diğer örneklenmiş konformasyonlar, soluk beyaz; MD simülasyonları öncesinde ilk yapıları, pembe. Tamirat ve ark.12’denşekil . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu çalışmada açıklanan protokol, EGFR kinazon alanının somatik mutasyonlarının aktive edilen lokal ve küresel yapısal değişiklikleri araştırmak için moleküler dinamik simülasyonlarının kullanılmasına odaklanmaktadır. Yabani tip ve mutant EGFR’lerin X-ışını kristal yapıları paha biçilmez yapısal bir kavrayış sağlasa da, bir veya birkaç statik temsili betimlener. Ancak, ErbBs biyolojik işlevinin doğasında enzimatik inaktif ve aktif tirozin kinaz arasında gerekli geçişler, hem yapı ve kinaz monomerler arasındaki intramoleküler etkileşimleri dinamik değişiklikler çağıran. Md simülasyonları böylece Vahşi tip yapısı, tanıtılan ΔELREA silme mutasyonu ve A702V mutasyonu da dahil olmak üzere EGFR tirozin kinaz etki alanının dinamik doğasını araştırmak için yapılmıştır. Bu simülasyonlar, bu mutasyonların yapılardaki olası rolünü ve tirozin kinaz alanının konformasyonu üzerindeki etkilerinin EGFR kinaz aktivitesinde deneysel olarak gözlenen artışlara nasıl yol açacağını açıklığa kavuşturmada başarılı oldu.

Bu protokoldeki önemli bir adım mutasyonun etkisini değerlendirmek için ilgili bir yapının kullanılmasıdır. İlgili bir simülasyon girdi yapısı seçmenin bir yolu, mutasyonun statik 3B yapısındaki yerini görselleştirmek ve komşu amino asitler ve yapısal birimler açısından olası etkisini incelemektir. Bu çalışmada, örneğin, A702V EGFR mutasyonu asimetrik dimer arayüzünü oluşturan yan yana B segmentinde bulunduğundan, monmeryerine simülasyon için dimer yapısının kullanılması önemlidir. Monomerik bir yapının kullanılması alıcı kilazın yan yana B segmentini çözücüye maruz bırakarak, mutasyonla daha büyük bir hidrofobik kalıntıya ve aktivatör kisenin C-lobe kalıntılarından izolösin 941 ile etkileşimlere karşı güçlendirilerek dengeleyici etkileşimlerden mahrum bırakacaktı. Ayrıca, bir PDB dosyasındaki koordinatlarla temsil edilen 3B yapının, çalışma için kullanılması gereken biyolojik olarak ilgili yapıyla örtüşmemesi de dikkat çekicidir. Örneğin, ErbB4, PDB kodu 3BCE yapısı ile, PDB koordinatları bir düzeltici karşılık gelir, ancak bu kristal kişiler nedeniyle (bu yapıgörselleştirirken monomerler arasında birkaç kişi görülür). PDB dosyasındaki matrisler ( örneğin, Chimera içinde) kristalografik olarak ilgili yapıları yeniden oluşturmak için kullanılabilir, orijinal yayında bildirildiği gibi biyolojik olarak ilgili 3D yapıya karşılık gelen zincirleri tanımlamak için görselleştirilebilir⁴². Protokolün bir diğer önemli adımı da, farklı döngü bölgelerinde ve özellikle mutasyonun çevresinde bulunan yerlerde eksik amino asitlerin oluşturulması gibi simülasyon giriş yapısını düzgün bir şekilde hazırlamaktır. PDB’de çok sayıda yabani tip EGFR yapısı bulunmasına rağmen, sadece sınırlı sayıda mutant EGFR yapısı mevcuttur. Sonuç olarak, mutant yapıların da modelalınması gerekir; A702V gibi tek bir kalıntı mutasyonu için, Chimera kalıntımutasyonetmek için kullanılmıştır; oysa ΔELREA silme mutasyonu için Model kullanılmıştır.

Simülasyon giriş dosyalarında kullanılan çeşitli parametreler – örneğin, en aza itimasyon döngülerinin sayısı, sistemi tek seferde istenilen sıcaklığa ısıtmak veya bunun yerine birkaç ara sıcaklıkta yavaş yavaş ısıtmak, denge ve üretim simülasyonları için zaman dilimi – çalışmanın molekülü, çalışmanın amacı ve kişinin kendi tercihleri temel alınarak değiştirilebilir. MD simülasyonları gerçekleştirirken, giriş dosyalarından, kullanılan simülasyon yazılımıyla ilgili sorunlardan ve hatta bir kullanıcı hatasından kaynaklanabilecek hatalarla karşılaşmak da yaygındır. Bu nedenle, herhangi bir hata iletileri dikkatle inceleyerek hataların kaynağını anlamak için çok önemlidir. Simülasyon programlarının çoğunda, kullanıcıların yazılım geliştiricilere ve diğer kullanıcılara çoğu sorunun çözülebileceği sorular sorabilecekleri bir posta listesi bulunur. Ayrıca, kullanım kılavuzları varsayımlar ve sınırlamalar da dahil olmak üzere simülasyon protokolünün ayrıntılarını anlamak için önemli yardım sağlar. MD simülasyonu moleküllerin dinamik özelliklerini keşfetmek için önemli bir araç olsa da, hesaplama sonuçlarının geçerliliklerini değerlendirmek için diğer bilgi kaynaklarıyla birlikte dikkatle değerlendirilmesi gerektiğini unutmayın. Mümkün olduğunda, özellikle ilgili ıslak laboratuvar deneysel çalışmaların yapıldığı yerlerde, yapısal yorumlama için sonuçlar sağlamanın yanı sıra hipotezleri test etmek için yapısal gözlemlere dayalı deneyler öneren, üzerinde uzman araştırmacılarla birlikte çalışın.

Bu çalışmada protokol, ΔELREA ve A702V mutasyonlarının EGFR kineler yapıları üzerindeki dinamik yapısal etkilerinin incelenmesinde etkili olmuştur. Simülasyonlar, ΔELREA’nın işlevsel olarak gerekli αC sarliğini dizginlediğini ve inaktif kinden stabilize aktif kinazaya konformasyonel bir değişimi desteklediğini ortaya çıkardı. Simülasyon sonuçları, tirozin kinaz inhibitörlerinin ΔELREA deletion mutasyonu ve yabani tip EGFR’ye sahip akciğer kanseri hücre hatları üzerindeki etkilerini gösteren ilaç yanıt verileri ile bağımsız olarak desteklenir ve burada aktif kinaz konformasyonu¹²tanıyan ilaçların daha fazla inhibisyonu rapor edilmiştir. A702V mutasyonu ile, MD simülasyonları, vahşi tipe kıyasla, aktivatör alıcısı kinase arabiriminin artan stabilizasyonunun yanı sıra aktivatör ve alıcı kigazının birbirleri için daha yüksek afinitesinin arttığını ve EGFR kisinin aktif konformasyonunun sürdürülmesini desteklediğini göstermektedir. Alıcı kininin yan yana b segmentinde bulunan A702V mutasyonu, aktivatör kinaz ile hidrofobik etkileşimleri artıracak ve aktive halsüresini uzatmak için çalışacaktır. A702V mutasyonu büyüme faktörü yokluğunda hücre sağkalımını destekler ve EGFR^{mutasyonları}için in vitro taramada tanımlanmış9.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma, Finlandiya Akademisi ‘nden (308317, 320005), Sigrid Juselius Vakfı ve Tor, Joe ve Pentti Borg anma fonundan Ve Finlandiya Akademisi’nden (274728, 316796), Finlandiya Kanser Vakfı’ndan ve Turku Üniversitesi Merkez Hastanesi’nden M.S.J.’e yapılan bağışlarla finanse edilmektedir. M.Z.T. Åbo Akademi Bilgi ve Yapısal Biyoloji Doktora Ağı tarafından finanse edilmektedir. Bilgi işlem kaynakları için CSC IT Center for Science’a ve Biocenter Finland biyoinformatik ağı altındaki BT desteği için Dr. Jukka Lehtonen’e teşekkür ederiz; ve Biocenter Finlandiya yapısal biyoloji altyapı ağı.

Materials

Amber software	University of California, San Francisco	Version 2018	Executable
Chimera program	Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco	Version 1.13.1	Executable
EGFR struture files	The Protein Data Bank		3D coordinates of EGFR structures
Maestro	Schrödinger LLC	Version 2018-3	Executable
Modeller program	The Andrej Šali Lab, Departments of Biopharmaceutical Sciences and Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco		Included in the Chimera program
VMD software	Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champaign	Version 1.9.3	Executable

References

Yarden, Y., Sliwkowski, M. X. Untangling the ErbB signalling network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 127-137 (2001).
Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Ferguson, K. M. The EGFR family: not so prototypical receptor tyrosine kinases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, a020768 (2014).
Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: From oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 2, 282-303 (2014).
Mishra, R., Hanker, A. B., Garrett, J. T. Genomic alterations of ERBB receptors in cancer: Clinical implications. Oncotarget. 8, 114371-114392 (2017).
. cBioPortal for Cancer Genomics Available from: https://www.cbioportal.org (2020)
Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. New England Journal of Medicine. 350 (21), 2129-2139 (2004).
Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from “never smokers” and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
Chakroborty, D., et al. Unbiased in vitro screen for activating EGFR mutations. Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9377-9389 (2019).
Leahy, D. J. Structure and Function of the Epidermal Growth Factor (EGF/ErbB) Family of Receptors. Advances in Protein Chemistry. 68, 1-27 (2004).
Roskoski, R. ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors. Pharmacological Research. 87, 42-59 (2014).
Tamirat, M. Z., Koivu, M., Elenius, K., Johnson, M. S. Structural characterization of EGFR exon 19 deletion mutation using molecular dynamics simulation. PLoS ONE. 14 (9), e0222814 (2019).
Ding, L., et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature. 455, 1069-1075 (2008).
Kurppa, K. J., Denessiouk, K., Johnson, M. S., Elenius, K. Activating somatic ERBB4 mutations in non small-cell lung cancer. Oncogene. 35 (10), 1283-1291 (2016).
Soung, Y. H., et al. Somatic mutations of the ERBB4 kinase domain in human cancers. International Journal of Cancer. 118, 1426-1429 (2006).
Tvorogov, D., et al. Somatic mutations of ERBB4: selective loss-of-function phenotype affecting signal transduction pathways in cancer. Journal of Biological Chemistry. 284, 5582-5591 (2009).
Hubbard, S. R., Till, J. H. Protein tyrosine kinase structure and function. Annual Review of Biochemistry. 69 (1), 373-398 (2000).
Huse, M., Kuriyan, J. The conformational plasticity of protein kinases. Cell. 109 (3), 275-282 (2002).
Jura, N., et al. Catalytic control in the EGF receptor and its connection to general kinase regulatory mechanisms. Molecular Cell. 42, 9-22 (2011).
Karplus, M., Kuriyan, M., J, Molecular dynamics and protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102 (19), 6679-6685 (2005).
Shan, Y., Arkhipov, A., Kim, E. T., Pan, A. C., Shaw, D. E. Transitions to catalytically inactive conformations in EGFR kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (18), 7270-7275 (2013).
Reckamp, K. L., et al. A phase I trial to determine the optimal biological dose of celecoxib when combined with erlotinib in advanced non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 12 (11 Pt 1), 3381-3388 (2006).
Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
Zhang, X., Gureasko, J., Shen, K., Cole, P. A., Kuriyan, J. An Allosteric Mechanism for Activation of the Kinase Domain of Epidermal Growth Factor Receptor. Cell. 125 (6), 1137-1149 (2006).
Stamos, J., Sliwkowski, M. X., Eigenbrot, C. Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46265-46272 (2002).
Sogabe, S., et al. Structure-Based Approach for the Discovery of Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based EGFR T790M/L858R Mutant Inhibitors. ACS Medicinal Chemistry Letters. 4 (2), 201-205 (2013).
Sali, A., Blundell, T. L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. Journal of Molecular Biology. 234 (3), 779-815 (1993).
Yun, C. H., et al. Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor complexes: mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity. Cancer Cell. 11 (3), 217-227 (2007).
Park, J. H., Liu, Y., Lemmon, M. A., Radhakrishnan, R. Erlotinib binds both inactive and active conformations of the EGFR tyrosine kinase domain. Biochemical Journal. 448 (3), 417-423 (2012).
. Release 2018-3: Maestro Available from: https://www.schrodinger.com/maestro (2018)
Case, D. A., et al. . AMBER 2018. , (2018).
Maier, J. A., Martinez, C., Kasavajhala, K., Wickstrom, L., Hauser, K. E., Simmerling, C. ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W., Klein, M. L. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. Journal of Chemical Physics. 79 (2), 926-935 (1983).
Meagher, K. L., Redman, L. T., Carlson, H. A. Development of polyphosphate parameters for use with the AMBER force field. Journal of Computational Chemistry. 24 (9), 1016-1025 (2003).
Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD: Visual molecular dynamics. Journal of Molecular Graphics. 14 (1), 33-38 (1996).
Melvin, R. L., Salsbury, F. R. Visualizing ensembles in structural biology. Journal of Molecular Graphics and Modelling. 67, 44-53 (2016).
Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
Miller, B. R., et al. MMPBSA.py: An Efficient Program for End-State Free Energy Calculations. Journal of Chemical Theory and Computation. 8 (9), 3314-3321 (2012).
Guha, U., et al. Comparisons of tyrosine phosphorylated proteins in cells expressing lung cancer-specific alleles of EGFR and KRAS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (37), 14112-14117 (2008).
Furuyama, K., et al. Sensitivity and kinase activity of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 19 and others to EGFR-tyrosine kinase inhibitors. Cancer Science. 104 (5), 584-589 (2013).
Qiu, C., et al. Mechanism of Activation and Inhibition of the HER4/ErbB4 Kinase. Structure. 6 (3), 460-467 (2008).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Tamirat, M. Z., Kurppa, K. J., Elenius, K., Johnson, M. S. Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation. J. Vis. Exp. (159), e61125, doi:10.3791/61125 (2020).

Automatically Generated