שימוש בציטומטריית זרימה כדי לזהות ולכמת היווצרות דם שהשתנתה בדגי הזברה המתפתחים
Summary
בדיקה זו היא שיטה פשוטה לכמת תאים hematopoietic בפיתוח זברה עוברית. תאי דם של דגי זברה מנותקים נתונים לניתוח ציטומטריה זרימה. זה מאפשר גילוי של מומים בדם בבעלי חיים מוטנטים ולאחר שינוי גנטי.
Abstract
המגוון של שושלת התאים המרכיבים דם בוגר בבעלי חוליות נובע מההבחנה בין תאי גזע וחולי אב מהמטופויטיים (HSPCs). זהו תהליך קריטי המתרחש לאורך תוחלת החיים של אורגניזמים, ושיבוש המסלולים המולקולריים המעורבים במהלך עובר יכול להיות בעל השלכות קטסטרופליות לטווח ארוך. מסיבות רבות, דג זברה (דניו rerio) הפך אורגניזם מודל ללמוד hematopoiesis. עוברי זברה מתפתחים מבחוץ, ובמשך 7 ימים לאחר ההפרה (dpf) יצרו את רוב תת-הסוגים של תאי דם סופיים שיימשכו לאורך חייהם. בדיקות להערכת מספר התאים ההמטופיאטיים פותחו, בעיקר תוך שימוש בכתמים היסטולוגיים ספציפיים, בטכניקות הכלאה במקום, ובמיקרוסקופיה של בעלי חיים מהונדסים המשתמשים ביחצנים ספציפיים לתאי הדם המניעים את הביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים. עם זאת, רוב מבחני הכתמים ובטכניקות הכלאה באתרו אינם מכמתים במדויק את מספר תאי הדם הקיימים; ניתן לראות בקלות רק הבדלים גדולים במספרי התאים. שימוש בבעלי חיים מהונדסים וניתוח אנשים עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או confocal ניתן לבצע, אבל הכמות של מבחנים אלה מסתמך על ספירה ידנית או ניצול תוכנת הדמיה יקרה, שניהם יכולים לעשות טעויות. פיתוח שיטות נוספות להערכת מספרי תאי הדם יהיה חסכוני, מהיר יותר, ואף יכול להיות אוטומטי כדי להעריך במהירות את ההשפעה של שינוי גנטי בתיווך CRISPR, הפחתת תעתיק בתיווך מורפולינו, ואת ההשפעה של תרכובות סמים המשפיעים hematopoiesis בקנה מידה גדול. זה מבחנים חדשניים כדי לכמת תאי דם מבוצעת על ידי ניתוק עוברי זברה שלמים וניתוח כמות תאי הדם שכותרתו פלואורסצנטית נוכח. מבחנים אלה צריכים לאפשר הבהרות של מסלולים מולקולריים האחראים על ייצור תאי הדם, התרחבות ורגולציה במהלך העובר, אשר יאפשר לחוקרים לגלות עוד יותר גורמים חדשניים ששונו במהלך מחלות דם, כמו גם מסלולים חיוניים במהלך האבולוציה של hematopoiesis בעלי חוליות.
Introduction
ייצור דם (hematopoiesis) הוא תהליך התפתחותי חיוני שמתחיל לראשונה בעובר המוקדם. תהליך זה מתחיל על ידי יצירת תאי דם אדומים פרימיטיביים מקרופאגים ישירות mesoderm, ומאוחר יותר נע לעבר הייצור של גזע hematopoietic ותאי אב (HSPCs). תאי גזע אלה, שהם רב-פוטנטיים, מייצרים את כל הזנים של תאי דם בוגרים באורגניזם. המערכת, המסוגלת לחדש את עצמה, מתחדשת ללא הרף באמצעות HSPCs אלה. בעוד תהליך זה מתחיל בשלב מוקדם בפיתוח, hematopoiesis ממשיך בחייו של החיה, מתן היכולת להעביר חמצן לאתרים רחוקים של הגוף, להפסיק דימום לאחר פציעה, כדי להגן על הגוף מפני זיהום. ההתפתחות של מערכת מורכבת זו נשלטת זמנית וספטילית במהלך הפיתוח וכל הפרעה בייצור תאי הדם יכולה להיות קטסטרופלית עבור האורגניזם, וכתוצאה מכך אנמיה, תרומבוציטופניה, לויקופניה ולוקמיה.
מודל חיה פופולרי המשמש למחקר hematopoietic הוא דג הזברה (דניו rerio) כי יש להם התפתחות דם דומה בהשוואה לבני אדם. למעשה, רבים מהגנים והמסלולים המולקולריים המשמשים במהלך hematopoiesis נשמרים לאורך האבולוציה החולייתנית, ומאפשרים לנו ללמוד על הגנים האנושיים על ידי לימוד זברה. חשוב לציין, עוברי זברה מתפתחים מחוץ לגוף ובתוך 7 ימים יצרו את סוגי תאי הדם הבוגרים ביותר, המאפשרים הדמיה ישירה של המערכת hematopoietic בתוך זמן קצר. דגי זברה הם גם פוריים ביותר, מה שמאפשר לחוקרים להתבונן במספר גדול יותר של דגימות במסגרת זמן קצרה, שחשובה גם ליצירת נתונים הניתנים לשחזור. זמן הדור הקצר של הזברה ופיתוח חיצוני מספק מניפולציה קלה יותר והתבוננות במהלך מחקרי mutagenesis1,2,3,4,5 ו סינון סמים6,7,8,9,10. זה מאפשר פאנל של תרכובות טיפוליות מבטיחות עבור הפרעות דם אנושי להיבדק במהירות וביעילות.
חשוב לציין, דגי זברה הם גם נוחים מבחינה גנטית, ואת הגנום הוא רצף ביאורים. אחיזה זו מאפשרת לבצע טכניקות גנטיקה הפוכה כגון הפלה בתיווך מורפולינו (MO-) ואבלציה גנטית בתיווך CRISPR. דגי זברה הוכיחו גם את התועלת שלהם כמודל לביצוע מסכים גנטיים קדמיים; גנים ומסלולים חיוניים רבים המעורבים בהיווצרות דם בעלי חוליות התגלו באופן זה. שיטות רבות של התבוננות בתאי דם פותחו גם זברה. בעוד טכניקות כתמים היסטולוגיות מסורתיות קיימות, ניתן גם לבצע במקום הכלאה עבור תעתיקים ספציפיים לדם. חשוב לציין, קווים מהונדסים רבים של דגים קיימים גם לפיה חלבונים פלואורסצנטיים באים לידי ביטוי על ידי מקדמים ספציפיים לשושלת, המאפשר תיוג של תאי דם ספציפיים עם חלבונים פלואורסצנטיים11. זה מאפשר לחוקרים לבצע תצפית עדכנית של בראשית תאי הדם, התרחבות ורגולציה באורגניזם חי לאורך זמן.
בסך הכל, שימור המערכת hematopoietic, נוכחות ופיתוח קל של קווים מהונדסים, הדמיה קלה, וזמן הדור הקצר הפך את דג הזברה מודל חסכוני, מהיר, הסתגלות של hematopoiesis. כדי לשפר את ארגז הכלים של טכניקות הזמינות לחוקרי זברה, פיתחנו את ההסמכה הזו כדי לכמת באופן חזק את מספר תאי הדם בעוברים. השיטה כוללת עיכול בעלי חיים מהונדסים וביצוע ציטומטריית זרימה לתאי דם פלואורסצנטיים. בדרך זו, תאי דם מבעלי חיים מוטנטים, ההשפעה של שינוי MO ו CRISPR, ואת ההשפעה של מולקולות קטנות ניתן לנתח כמותית באופן מהיר לשחזור. מבחנים אלה הם דרכים ידידותיות למשתמש וחסכוניות לספירת תאי דם, המאפשרות בדיקה של הדור שלהם, התפשטות, ותחזוקה לאורך זמן.
Protocol
Representative Results
Discussion
דגי זברה הם מערכת מודל מצוינת לחקר המטופוזיס פרימיטיבי ומוחלט של בעלי חוליות. במהלך העשורים האחרונים פותחו ושוכללו מבחנים מרובים, המאפשרים לדגי זברה להפוך למודל מהיר וחסכוני לבדיקת תרופות, יצירה ובדיקה של מוטנטים גנטיים, ובסך הכל מאפשרים לחוקרים לנתח מסלולים מולקולריים החיוניים להמטופו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המימון ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH: R15 DK114732-01 ל- D.L.S.), הקרן הלאומית למדע (NSF: MRI 1626406 ל- D.L.S.), ומתוכנית הכבוד באוניברסיטת קליפורניה צ’יקו (ל- K.F.R.). המחברים מודים לבטסי טמיאטי על ניהול המעבדה וקתי ג’ונס על הסיוע האדמיניסטרטיבי.
Materials
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
References
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. , 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).
- Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).
- Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. . Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , (2009).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. Zebrafish Kidney Development. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. 100, 233-260 (2010).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).
- Ganis, J. J., et al. Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR. Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, e1-e11 (2013).
- Ding, M., et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective. SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).
- Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies. Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).
- Joslin, J., et al. A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery. SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).
