종양 내 이질성, 온코스트림 및 침략의 공간 및 분자 특성화를 위한 신경교종 소구역의 레이저 캡처 미세 분해
Summary
레이저 미세 해부 (LMD)는 신경교종 이질성과 침략을 중재하는 통로를 밝히기 위하여 이용될 수 있는 민감하고 높게 재현가능한 기술입니다. 여기에서, 우리는 전사성 분석에 선행된 레이저 LMD를 사용하여 신경교종 조직에서 이산 지역을 격리하기 위하여 최적화된 프로토콜을 기술합니다.
Abstract
글리오마는 그들의 침략성과 이질성을 특징으로 하는 1 차적인 뇌종양입니다. 의사 팔리세이드, 미세 혈관 증식, 중간엽 변형 및 괴사와 같은 특정 조직학적 패턴은 고급 신경교종의 조직학적 이질성을 특징으로합니다. 우리의 실험실은 온코 스트림이라는 이름의 중간 엽 세포의 높은 밀도의 존재가 종양 악성 종양과 상관 관계가 있음을 입증했습니다. 우리는 신경교종의 성장과 침략의 기초가 되는 기계장치를 이해하기 위하여 독특한 접근을 개발했습니다. 여기서, 우리는 레이저 포획 미세 내부(LMD) 및 RNA 염기서열 분석을 활용하여 종양 내 이기종 다세포 구조(즉, 중간엽 영역 또는 종양 침윤 영역)의 미분 mRNA 발현을 분석하는 포괄적인 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 좋은 조직 조직학 및 RNA 무결성을 유지합니다. 관류, 동결, 임베딩, 단면화 및 염색은 형태를 보존하고 고품질 레이저 미세 해부 샘플을 얻기 위해 최적화되었습니다. 결과는 30% 자당을 사용하여 신경교종 베어링 마우스의 관류가 좋은 형태와 RNA 질을 제공한다는 것을 표시합니다. 또한, 4% 크레실 바이올렛과 0.5% 에오신으로 종양 섹션을 염색하면 RNA 무결성을 유지하면서 좋은 핵 및 세포 염색을 초래합니다. 기재된 방법은 민감하고 매우 재현성이 있으며 다양한 종양 모델에서 종양 형태를 연구하는 데 활용될 수 있다. 요약하면, 우리는 고형 종양 내의 이기종 다세포 구조의 분자 특징을 연구하기 위해 시퀀싱을 위한 형태학 및 RNA 품질을 보존하는 LMD를 수행하는 완전한 방법을 설명합니다.
Introduction
신경교종은 중추 신경계의 가장 공격적인 원발성 종양입니다. 그들은 매우 침략적이고 이질적인1. 종양의 세포 및 분자 분대의 분석은 새로운 치료 표적을 드러낼 것입니다.
현재 이용 가능한 다른 방법 들 중에서, 동결 된 뇌 종양 조직의 레이저 캡처 미세 해부 (LMD)는 종양 조직에서 이산 해부학 영역 또는 특정 세포 집단을 분리하여 분자 프로필을 연구 할 수있는 비용 효과적이고 신뢰할 수있는 기술입니다2,,3. LMD는 선택된 단일 세포 또는 다세포구조의mRNA 유전자 발현 프로파일의 분석을4,5. LMD는 종양 진행 도중 일어나는 분자 사건에 관하여 심층적인 기계론적인 지식을 얻기 위하여 이용될 수 있습니다. 종양 조직의 처리개선은 조직 형태와 RNA 품질6의최적의 광학 적 분해능을 얻기 위해 필요하다. 파라포름알데히드 고정이 형태학적 분석을 위한 최선의 선택이지만, RNA 품질은 이러한 조건하에서 영향을 받고 저하되어 RNA-seq 분석을 위한 RNA 품질이 저하됩니다. 동결 된 조직 섹션의 사용은 세포막을 부수고 세포 내의 구멍을 생성 할 수있는 얼음 결정 형성을 피하고 RNA-Seq 분석7을위한최상의 옵션으로 남아 있습니다.
여기서, 우리는 LMD에 대한 동결 마우스 뇌종양 조직을 처리하기 위해 최적화된 단면 고정 및 염색 방법을 설명한다. 얼음 결정이 조직에서 형성되는 것을 방지하기 위해, 우리는 30 % 자당의 용액으로 마우스를 주입했습니다. 이 용액은 극성 물 분자 사이의 상호 작용을 방해하고 얼음 결정의 형성을 방지하여 조직 형태를 보존합니다. 조직 염색은 종양 내의 세포 또는 해부학적으로 명백한 지역의 특정 인구를 분화하고 장악하기 위하여 필요합니다. RNA 무결성을 유지하기 위해 무해한 염료로 조직을 수정하고 염색하는 것이 필수적입니다. 이전에 는 헤마톡신/에오신(H&E)으로 조직을 염색하면 RNA 무결성이 저하되는 것으로 나타났습니다8. 우리는 에탄올, 크레실 바이올렛 4%, 에오신 Y 0.5% 솔루션으로 관심 조직을 고정하고 염색했습니다. 크레실 바이올렛은 진한 청색으로 세포 핵을 더럽는 산성염 염료입니다. Eosin Y는 세포의 기본 성분을 더럽게 하는 호염약 염료로, 세포질및 다른 세포 구조 의 구별을 제공하는8. 두 염료 모두 에탄올에 용해되며 RNA 품질을 저하시키지 않습니다. 조직 손상을 방지하고 세포 구조의 높은 광학 해상도를 유지하기 위해 LMD9이전에 조직 섹션을 장착했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신경교종 이질성 및 침략의 근본적인 분자 기전을 이해하는 것은 새로운 치료표적13을밝히는 것이 매우 중요하다. 이 원고에서는 레이저 포획 미세 해부(LMD)를 이용한 신경교종 이질성 및 침범의 분자 경관을 분석하고 전사성 분석을 통해 보다 자세하고 최적화된 방법을 설명합니다.
레이저 포획 미세해부(LMD)는 종양 내의 상이한 영역 또는 단일 세포를 식별…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
작업은 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다, (NIH / NINDS) 보조금: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 M.G.C.; (NIH/닌드) R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311을 P.R.L.에 부여합니다. (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; 미시간 대학의 로겔 암 센터, 채드터프 재단, 레아의 해피 하트 재단에서 M.G.C. 및 P.R.L. RNA 생물 의학 그랜트 F046166에 신경 외과의 학과, UL1 TR002240 미시간 임상 및 건강 연구 (MICHR), 연구 및 건강 연구 (MICHR) 프로젝트 F049768 미시간 포브스 암 연구소의 A.C. 대학, 실명을 방지하기 위해 연구에서 의사 – 과학자 상, Inc., Inc.,(RPB), NIH의 NEI에서 R01 EY022633을 부여 (AK), 및 안과 및 시각 과학의 부서에 RPB에서 무제한 보조금. 이 연구는 비전 연구 코어 (P30 EY007003) 및 암 센터 연구 코어 (P30 CA046592)를 활용했습니다. AK는 A. 알프레드 타우브만 의학 연구소에서 부인 윌리엄 데이비슨 신흥 학자 상에 의해 지원됩니다.
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin – Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
References
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