Простой литографии-бесплатно одноклеточных микропаттернинга с помощью лазерной-Cut stencils
Summary
Этот протокол вводит метод микропаттернирования без литографии, который прост и доступен для тех, кто имеет ограниченный биоинженерный опыт. Этот метод использует индивидуальные лазерно-вырезанные трафареты для микропаттернвальных внеклеточных матричных белков в форме, представляющих интерес для модуляции морфологии клеток. Процедура микропаттернирования продемонстрирована с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитами.
Abstract
Методы микрошаблонирования широко использовались в клеточной биологии для изучения влияния контроля формы и размера клеток на определение судьбы клеток при разрешении одной клетки. Современные современные методы микропаттернирования одноклеточных элементов включают мягкую литографию и микроконтактную печать, которая является мощной технологией, но требует подготовленных инженерных навыков и определенной поддержки объектов в микрофабрикации. Эти ограничения требуют более доступной техники. Здесь мы описываем простой альтернативный метод, свободный от литографии: шаблон на основе трафаретов на основе одной ячейки. Мы предоставляем пошаговые процедуры, включая конструкцию трафарета, изготовление гидрогеля полиакриламидов, внеся белковое включение на основе трафаретов, а также клеточное покрытие и культуру. Этот простой метод можно использовать для шаблона массива до 2000 ячеек. Мы демонстрируем узор кардиомиоцитов, полученных из одного человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) с различными формами клеток, от 1:1 квадрата до 7:1 взрослых кардиомиоцитов, как прямоугольник. Этот трафаретный одноклеточный узор без литографии, технически прочный, удобный, недорогой и, самое главное, доступный для тех, кто имеет ограниченный биоинженерный опыт.
Introduction
Появление hiPSCs и последующее развитие протоколов для их направленной дифференциации на различные типы клеток позволили изучить развитие и болезни на молекулярном и пациент-специфическом уровне, в частности, с использованием кардиомиоцитов iPSC (iPSC-CMs) для моделирования кардиомиопатий1,2. Однако основным ограничением для изучения развития и физиологии с использованием системы iPSC и других моделей in vitro является отсутствие структурированной микросреды. На месте клетки подвергаются ограничениям внеклеточной матрицы (ECM), а также соседних клеток. Особый биохимический состав и жесткость этих микросред диктуют пространственное распределение клеток, а также факторы, доступные для участия в стеге клеточной печении. Это, в свою очередь, влияет на внутриклеточные сигнальные пути, экспрессию генов и определение судьбы клеток. Например, микропаттернированный iPSC-CM в взрослой форме стержня имеет значительно лучшую сократительную способность, кальцийпоток, митохондриальную организацию, электрофизиологию и поперечное образование3. Таким образом, свойства микросреды являются неотъемлемой частью регулирования клеточных функций.
Предыдущие методы микропаттернинга в значительной степени опирались на фотолитографию(рисунок 1A). В этом методе, слой фоточувствительного полимера, или photoresist, вращается на плоском субстрате из раствора, чтобы сформировать тонкую пленку толщиной около 1 мкм. Далее ультрафиолетовый (УФ) свет наносится на фотоустойчивость через маску, содержащую желаемый узор. Воздействие ультрафиолетового (УФ) света химически изменяет фотоустойчивость, изменяя его растворимость в соответствующем решении разработчика, перенося желаемый узор из маски на субстрат. Многие методы микропаттернов включают фотолитографию, поскольку она наделяет нанометр микрометровым контролем над конструкцией клеточных узоров. Тем не менее, спиннинг фоторезиста очень чувствителен к примесям, так как мельчайшие частицы пыли нарушит распространение раствора в тонкую пленку. Поэтому фотолитография должна осуществляться на незагрязненных объектах, которые являются дорогостоящими в обслуживании и требуют специальных знаний для использования. Кроме того, химические вещества, используемые в фотолитографии часто токсичны для клеток и могут денатурировать важные биомолекулы. Таким образом, фотолитография создает значительные препятствия для изготовления микрошаблонов для удобного биологического применения.
В 1994 году Whitesides и его коллеги4 преодолели некоторые проблемы, связанные с фотолитографией, впервые в ней собрал коллекцию методов, называемых мягкой литографией. В мягкой литографии, микроструктурированная поверхность сделанная с polydimethylsiloxane (PDMS), прозрачным, резиноподобным материалом, использована для того чтобы произвести картину протеинов ECM4. Общие мягкие литографические методы включают микроконтактную печать и микрофлюидный узор. В микроконтактной печати, в настоящее время наиболее популярным мягким литографическим методом, штамп PDMS, покрытый белками ECM, передает материал на поверхность в районах, с которыми контактирует марка(рисунок 1B). При микрофлюидном узоре микроструктуры проектируются на поверхности PDMS таким образом, что при нажатии на подтекст штамп создается сеть микроканалов, через которые жидкости могут доставляться в нужные области (рисунок 1С)5. Мягкая литография предлагает несколько преимуществ по сравнению с фотолитографией. После того, как мастер пластины microfabricated, PDMS марки могут быть легко воспроизведены без дальнейшего трудоустройства чистых помещений. Кроме того, отсутствие органических растворителей в процессе мягкой литографии позволяет использовать полимерные материалы, такие как полистирол, обычно используемые в клеточной культуре. Наконец, микропаттернирование с использованием мягких литографических методов не ограничивается плоскими поверхностями. Таким образом, мягкая литография повышает доступность и функциональность изготовления микрошаблона по сравнению с фотолитографией6. Однако мягкая литография имеет существенные недостатки. Например, начальный шаг травления, с помощью фотолитографии, по-прежнему требуется для микрофабриката марки. Кроме того, микропаттернирование с использованием штампа PDMS подвержено изменениям в качестве переноса белка на субстрат6. Избежание этих расхождений требует оптимизации и согласованности давления, применяемого к штампу PDMS во время переноса белка, в противном случае деформация и искажение размеров функций форм PDMS может произойти6. Существует также серьезная озабоченность неоднократно госиспользованием PDMS из-за поглощения малых молекул7.
Чтобы избежать использования мягкой фотолитографии и штампов PDMS, мы описываем метод микропатии на основе трафаретных элементов, свободных от литографических одноклеточных элементов, который преодолевает многие препятствия, связанные с фотолитографией и мягкой литографией. В этом методе, гидрогель полиакриламид используется в качестве субстрата для ввода белка eCM на основе трафаретов, что позволяет селективное покрытие одного hiPSC-CMs. Этот метод очень совместим с полимерными материалами, используемыми в классических условиях клеточной культуры. Кроме того, при надлежащей очистке и обслуживании трафареты многоразовые и устойчивы к деградации и поглощению белка в процессе микрофабрикации. Наконец, процесс шаблонирования является технически надежным, недорогим, настраиваемым и доступным для тех, кто не имеет специализированных навыков биоинженерии. Этот трафарет на основе микропаттернинга техника была широко использована в наших последних публикациях моделирования разнообразных кардиомиопатий8,9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем метод микропаттернирования на основе литографии, который позволяет эффективно узорить клетки адептов. В этом протоколе мы демонстрируем узорство hiPSC-CMs в различных соотношений длины и ширины путем микропаттернинга подвальной мембранной матрицы белковых островов на гидр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана постдокторской стипендией от Стэнфордского научно-исследовательского института здоровья детей (CHRI) и Национального института здравоохранения (1F32HL142205-01) в S.L. NIH Офис Директора Pioneer Award (LM012179-03), Американская ассоциация сердца учрежденных следователя премии (17EIA33410923), Стэнфордский сердечно-сосудистый институт, Хоффманн и Шрёпфер Фонда, и Стэнфордский отдел сердечно-сосудистой медицины, Департамент медицины S.M.W , Награды От Национального института здравоохранения (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) и программа исследований заболеваний, связанных с табаком (TRDRP 27IR-0012) в J.C.W, Американская ассоциация сердца (AHA) Постдокторская стипендиальная премия (18POST3030106) в H.Y. Мы благодарим д-ра Эндрю Олсена из Стэнфордской службы микроскопии неврологии за поддержку конфокальной визуализации микрошаблона hiPSC-CM. Мы благодарим H.Y. за первый дизайн трафарета, изготовление, одноклеточный микропаттерн iPSC-CM на полиакриламидном гидрогеле с покрытием крышкой, а также предварительное конфоковое изображение саркомерной структуры одноклеточных микрошаблонов iPSC-CMs.
Materials
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
