Exon Пропуск в непосредственно перепрограммированных Myotubes Полученные из человеческих мочи производные клетки

Комитет по этике Национального центра неврологии и психиатрии одобрил это исследование (идентификатор одобрения: A2017-018, A2018-029). Все люди дали информированное согласие, прежде чем предоставить мочу. Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и положениями. 1. Изоляция и первичная культура УДК ПРИМЕЧАНИЕ: UDCs были изолированы в соответствии с ранее опубликованным протоколом8,9,10 с некоторыми изменениями. Сбор образцов мочи во время спонтанного миктурации в стерилизованных пластиковых бутылках.ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизация внешнего уретры не требуется. Моча среднего течения желательно снизить риск вирусного заражения. Если запас времени до следующей процедуры составляет 1 ч, образцы мочи должны быть переданы на 4 кВ, чтобы сохранить жизнеспособность клетки. Тем не менее, следует избегать температуры lt;4 c, так как могут появиться нерастворимые осадки. Centrifuge весь образец мочи на 400 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Аспирируй супернатанта, оставляя 1 мл в трубке. Приготовьграйте гранулы индивидуально в оставшиеся 1 мл мочи, а затем соберите их в одной трубке 50 мл. Добавьте 10 мл стирального буфера, состоящего из 99 мл PBS без кальция и магния, 1% пенициллина/стрептомицина (P/S), 0,5 мкг/мл амфотерицина В, и центрифугу образцы при температуре 200 х г на 10 мин при комнатной температуре. Призадыхать супернатант, оставляя 0,2 мл в трубке. Приостановить действие клеточных гранул в 4,5 мл первичной среды, состоящей из смеси 1:1 модификации высокой глюкозы Dulbecco Eagle medium (DMEM) без пирувата натрия и питательной смеси Фарма Фарма, дополненной рекомбинантным человеческим эпидермальным фактором роста (EGF), инсулином, гидрокортизон, эпинефрин, Т3, трансферрин, 10% тетрациклин без сыворотки для крупного рогатого скота (FBS), 1% P/S, и 0,5 мкг/мл амфотерицин B. Семя клеток в трех колодцах желатина покрытием шесть скважин (общий объем каждой скважины, 1,5 мл). Культура увлажняет при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 24 ч. Добавить 1,5 мл первичной среды ежедневно в течение следующих 3 дней. На 4-й день замените среду 1,5 мл среды роста, дополненной рекомбинантным ЧЕЛОВЕЧЕСКИм EGF, инсулин, гидрокортизон, эпинефрин, T3, трансферрин, 15% тетрациклин без FBS, 0,5% L-аланин-L-глютамин, 0,5% несущественные аминокислоты, и 2,5 нг/мЛ фибробластный фактор роста-основной (bFGF), рекомбинантный человеческий платок-производный фактор роста (PDGF). Изменение среды роста через день.ПРИМЕЧАНИЕ: колонии UDC появляются в течение недели. Когда культура UDC становится 80-90% слияния, удалить средних и мыть клетки с PBS, разделить все клетки, используя 0,25% трипсин-EDTA и семян на 3000-5000 клеток / см2 на новый желатина покрытием 60 мм блюдо (проход 1).ПРИМЕЧАНИЕ: UdCs может храниться в жидком азоте. UDCs обычно разделены на 60’70% confluency в тарелке культуры 60 mm в 3 пробки штока. 2. Ретровирная конструкция Усиль область кодирования MYOD1 (NM_002478.4) плазмидса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь для усиления MYOD1 и условия для теплового циклизатора показаны в таблице 1 и таблице 2,соответственно. Обнаружить одну полосу около 1000 bp размер на 0,7% агарозного геля электрофорусс с использованием 1 Зл из усиленного продукта ПЦР, чтобы подтвердить, что myOD1 последовательность усиливается успешно. Очистите продукт ПЦР с помощью комплекта очистки и определите его концентрацию с помощью спектрофотометра. Инкубировать смесь, как показано в таблице 3 на 37 градусов по Цельсию на ночь переварить ретровирусный вектор с тет-на системы и пуромицин устойчивый ген при ограничении ферментцелевых регионов в множественном месте клонирования. Обнаружить одну полосу на 0,7% агарозного геля электрофоресиса с использованием 1 Зл переваренный продукт, чтобы подтвердить, что ретровирусный вектор был успешно переварен. Очистите переваренный продукт с помощью комплекта очистки и определите его концентрацию с помощью спектрофотометра. Для клонирования усиленного фрагмента MYOD1 (произведенного шагами 2.1-2.3) в переваренный ретровирусный вектор (произведенный шагами 2,4–2,6) выполняется реакция клонирования синтеза. Настройте реакцию, как показано в таблице 4,инкубировать реакцию в течение 15 минут при 50 градусах Цельсия, а затем поместите на лед. Выполните трансформацию с использованием компетентных ячеек E. coli в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов). Выберите преобразованные компетентные клетки, культивируя на пластине культуры LB, состоящей из 10 г/л бактеритто триптона, 5 г/л экстракта дрожжей bacto, 5 г/l NaCl, 15 г/l бакто агара и 50 мг/l ампициллин. Возьмите выбранную колонию и культуру в среде культуры LB без бакто агара при 200 об/мин при 37 градусах Цельсия на ночь. Очистите MYOD1-вставленныеретровирусные векторы с помощью плазмидного комплекта очистки(Таблица материалов)и количественно с помощью спектрофотометра. Подтвердите, что MYOD1 правильно вставляется в ретровирусный вектор путем прямого секвенирования продукта ПЦР, усиленного вперед и обратными грунтовками, ориентированными соответственно с обеих сторон по вставленной последовательности MYOD1.ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность MYOD1 может быть обнаружена зажатой между ретровирусными векторными последовательностями, когда клонирование в синтезе успешно. Для ретровирусного производства, семена упаковочных клеток на 50000 клеток / см2 на 10 см коллагена покрытием пластин и культуры в DMEM с 10% FBS увлажнена при 37 КС и 5% CO2 на 24 ч. Когда упаковочные клетки размножаются до 80% сплава, смешайте 30 мкг ретровирусных векторов MYOD1,30 мкг упаковочных векторов и трансфекционный реагент, содержащий клеточный пептид(Таблица материалов) путем вихря, и инкубировать их в течение 10 мин. Добавьте инкубированную смесь к среде упаковочных клеток и культуры увлажненных при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.ПРИМЕЧАНИЕ: Коллагеновое покрытие необходимо. Трансфекция может быть лучше на 24 ч или более после посева, потому что упаковочные клетки легко отделиться от культуры пластины. После 4 ч или на ночь, изменить среднюю на свежую среду роста. Соберите вирусный супернатант и заменить свежей среде на 24 и 48 ч после котрансфекции и объединить супернатант. Чтобы сконцентрировать вирусный супернатант, смешайте его с реагентом концентратора и инкубируйте при 37 градусах Цельсия на ночь, затем центрифуге при 1500 х г в течение 45 мин при 4 градусах Цельсия. Фильтр ретровирус супернатант через фильтр PVDF с 0,45 мкм поры. Проверьте титр ретровирусного вектора с помощью количественного комплекта ПЦР и системы теплового цикла в соответствии с инструкциями производителя. Разделите вирусный супернатант на мелкие аликуты и запасите их при -80 градусах Цельсия. 3. Инфекция MYOD1-ретровирусным вектором в УДК Семя UDCs на 3000-5000 клеток / см2 на желатине покрытием 60 мм блюдо. После 24 ч посева, заразить размороженный ретровирус (шаг 2.21) на множественность инфекции 200, добавив гексадиметрин бромид в концентрации 8 мкг/мл. После 24 ч инкубации увлажненный при 37 КС и 5% CO2, заменить среду культуры со свежим ирост среды, содержащей 1 мкг/мл пуромицин, чтобы выбрать MYOD1-трансумированных клеток. MYOD1 Изменение среды через день.ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе для MYOD1-положительныхклеток, 1 мкг/мл пуромицин обычно используется для выбора. Соответствующая доза должна быть определена. Используйте тарелку, содержащую нетрансинфицированные клетки, и выберите дозу, которая убивает все клетки в течение 3-5 дней. MYOD1-положительныеклетки должны быть выбраны в течение 7-10 дней после добавления пуромицицина. MYOD1-трансумированные УДК могут храниться в жидком азоте. MYOD1 4. Миогенная дифференциация МИОД1-трансумированныхУДК, обработанных гидрохлоридом 3-деазанепланоцина А (ДЗНеп) ПРИМЕЧАНИЕ: В последнее время было сообщено, что Дзнеп, ингибитор гистон метилтрансферазы, может значительно способствовать выражению MYOGENIN, один из поздних факторов регулирования мышц, а также привести к дифференциации миотубетуса7. Плита MYOD1-трансумированные УДК в колонадистых колодцах при плотности 3,5 х 104 клетки/см2. Культура увлажнена при 37 градусах Цельсия и 5% CO2. После 24 ч, изменить среду роста к дифференциации среды, состоящей из высокой глюкозы DMEM с L-аланин-L-глютамин, 5% лошади сыворотки, ITS дополнения, 1 мкг /мл доксициклин, и 5 ММ ДЗНеп.ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор 10 мМ Дзнеп может храниться при -80 градусов по Цельсию в течение 3 месяцев. Используйте морозильник для размораживания и избегайте повторных циклов замораживания-оттепели. Оба MYOD1 активированы доксициклина и Дзнеп подавляют пролиферацию и способствуют миогенной дифференциации УДК. Поэтому рекомендуется добавлять доксициклин и Дзнеп после индукции миогенной дифференциации. ДЗНеп способствует миогенной дифференциации MYOD1-UDCsв зависимости от дозы образом. С другой стороны, он показывает цитотоксичность при высокой концентрации. Таким образом, определить соответствующую концентрацию ДЗНеп, начиная от 1’10 мкм в зависимости от его воздействия на миогенной дифференциации и клеточной биодоступности. Через 3 дня измените среднюю дифференциацию на свежую среду дифференциации без ДЗНеп. Затем, изменить среду каждые 3 дня.ПРИМЕЧАНИЕ: UDCs предприимчивы друг к другу и образуют миотубевы в течение 1-2 недель после дифференциации. 5. Exon пропуск в MYOD1-преобразованных UDCs ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описаны три протокола для оценки пропуска экзона в клетках, полученных из числа пациентов: 1) обратная транскриптаза полимеразной цепной реакции (РТ-ПЦР) дистрофина мРНК; 2) полуколичественное восстановление восстановленного сигнала белка дистрофина западным пятном; и 3) полуколичественное образование восстановленного сигнала флуоресценции дистрофина с помощью иммуноцитохимии. Все методы могут обнаружить экзон пропуск в дозе-зависимым образом. Оценка эффективности пропуска экзона ПО RT-PCR Для трансфекта антисмыслового олигонуклеотида (ASO) в MYOD1-преобразованныеUDCs, полученные от пациентов DMD на 7 день после дифференциации, смешайте ASO, трансфекционный реагент(Таблица материалов),и дифференциация средняя до конечной концентрации от 1’10 qM. Культура увлажненной при 37 C и 5% CO2. После 72 ч инкубации с ASO, изменить среднюю на свежую среду дифференциации без ASO. От 3 до 7 дней после трансфекции ASO, удалить дифференциации среды и мыть 1x с PBS. Добавьте буфер лиза клетки, лисите UDCs и собирайте полную РНК с помощью комплекта экстракции РНК. Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра. Объедините необходимые реагенты для одноступенчатой реакции РТ-ПЦР в пЦР-трубках в соответствии со таблицей 5. Поместите пЦР трубки со смесью в термоциклер. Выполнить термоцикл, в соответствии с таблицей 6. Выполните микрочип электрофорекс и рассчитать экзон пропуская эффективность с помощью молярной концентрации, как ниже.Exon пропуская эффективность (%) – пропущенная полоса / (пропущенная полоса , непропущенная полоса) x 100ПРИМЕЧАНИЕ: Храните продукт ПЦР в холодильнике при 4 градусах По кв/ для кратковременного хранения или -20 градусов для длительного хранения. Обнаружение дистрофина после пропуска экзона западным блоттингом Трансфект ASO и культура MYOD1-UDCs в соответствии со шагами 5.1.1 и 5.1.2. Изменение среды каждые 3 дня. После 2 недель дифференциации, извлечь общий белок из культивированных клеток с помощью радиоиммунопреционных анализ (RIPA) буфер, содержащий ингибиторы протеазы. Сножате лисаты на льду и центрифуге при 14 000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия. Соберите супернатант и определить концентрации белка с помощью комплекта анализ овак протеина BCA. Добавьте 15 мкг общего белка в трубку 0,5 мл и разбавьте, добавив буфер RIPA, содержащий ингибиторы протеазы, в общий объем 10 л. Выполнить 15 мкг общего белка на полосу. Добавьте образец буфера, уменьшая агент, и деионизированной воды, как показано в таблице 7. Денатурная клетка лисатируетпри при 70 градусах по Цельсию в течение 10 мин. Подготовьте трехацетатный бегущий буфер, содержащий 8,95 г/л трицина, 6,06 г/л трис базы, 1,0 г/л натрия додецил сульфат (SDS). Загрузите образец (20 л) на трис-ацетат 3-8% геля и выполните электрофорус при 150 В в течение 75 мин. Приготовьте буфер для промотирования без метанола. Замочите мембрану PVDF на 20 с метанола, а затем в буфере для промокать до использования (не менее 10 мин). Вырежьте мембрану PVDF размером 6 х 8 см с помощью мини-гелей и 8 х 12 см с помощью миди гелей. Вырезать промокать бумаги до того же размера, что и мембраны PVDF и впитать те, в буфере blotting до использования. После электрофореза разрежьте гель до того же размера, что и мембраны PVDF, и замочите гель в дистиллированной воде. Поместите блохитые бумаги, мембрану PVDF и гель на полусухом переносном аппарате(рисунок 1). Передача на 4 мА/см2 за 30 мин. Промыть мембрану 2x дистиллированной водой. Приготовьте антидистрофин (1:500) и анти-тубулин (1:1,200) в качестве основных антител. Подготовка HRP-конъюгированных анти-мышь антитела (1:100) в качестве вторичного антитела. Инкубировать мембраны с первичными антителами, мыть с буфером мытья, затем инкубировать с вторичными антителами с помощью автоматизированного устройства западной обработки(Таблица материалов) при комнатной температуре.ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-я-тубулин антитела, как правило, используется в качестве контроля нагрузки. Смешанные первичные антитела, в том числе 1:500 антидистрофина и 1:1,200 анти-тубулин антитела хорошо работают, когда реакция антител выполняется одновременно. Промыть мембрану в дистиллированной воде. Обнаружить белки с помощью химикуминенового обнаружения реагента и заряда-связанных устройств (CCD) камеры на основе изображения. Анализ данных с помощью соответствующего программного обеспечения. Обнаружение дистрофина после пропуска экзона иммуноцитохимией Непосредственно перепрограммировать UDCs в миотубебы в коллагена покрытием 96 хорошо пластины в соответствии с шагами 4.1’4.3. ТрансфектИровать ASO и культуры MYOD1-UDCs в соответствии с шагами 5.1.2 и 5.1.3. После 2 недель дифференциации, мыть клетки с PBS и исправить их в 4% параформальдегида в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Permeabilize MYOD1-UDCs в 0,1% неионического моющего средства в течение 10 мин при комнатной температуре и блокировать тех, с 10% козьей сыворотки в течение 15 мин при температуре 37 градусов по Цельсию. Инкубировать клетки с первичным антителом на ночь при 4 градусах Цельсия. Вымойте клетки с PBS и инкубировать те, со вторичным антителом в течение 30 минут при комнатной температуре.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мышь анти-дистрофина (1:30) используется в качестве основного антитела, анти-мышь IgG используется в качестве вторичного антитела, и Hoechst (1:10000) используется для окрашивания ядер. Изображение пластин с помощью флуоресцентного микроскопа и использовать анализатор для полуколичественной флуоресценции сигнала автоматически в каждом колодце при том же состоянии.