Dit manuscript beschrijft een genoom-schaal celgebaseerde screening benadering om extracellulaire receptor-ligand interacties te identificeren.
Intercellulaire communicatie bemiddeld door directe interacties tussen membraan-embedded celoppervlak receptoren is cruciaal voor de normale ontwikkeling en werking van meercellige organismen. Het detecteren van deze interacties blijft technisch uitdagend, echter. Dit manuscript beschrijft een systematische genoom-schaal CRISPR / Cas9 knock-out genetische screening aanpak die cellulaire trajecten die nodig zijn voor specifieke cel oppervlak erkenning gebeurtenissen onthult. Deze test maakt gebruik van recombinant eiwitten geproduceerd in een zoogdier eiwit expressie systeem als fervent bindende sondes om interactie partners te identificeren in een cel-gebaseerde genetische scherm. Deze methode kan worden gebruikt om de genen te identificeren die nodig zijn voor celoppervlak interacties gedetecteerd door recombinant bindende sondes die overeenkomen met de ectodomains van membraan-embedded receptoren. Belangrijk, gezien de genoom-schaal aard van deze aanpak, het heeft ook het voordeel van niet alleen het identificeren van de directe receptor, maar ook de cellulaire componenten die nodig zijn voor de presentatie van de receptor aan het celoppervlak, waardoor waardevolle inzichten in de biologie van de receptor.
Extracellulaire interacties door celoppervlak receptor eiwitten directe belangrijke biologische processen zoals weefsel organisatie, gastheer-pathogene erkenning, en immuun regulering. Het onderzoeken van deze interacties is van belang voor de bredere biomedische gemeenschap, omdat membraanreceptoren bruikbare doelwitten zijn van systematisch geleverde therapieën zoals monoklonale antilichamen. Ondanks hun belang blijft het bestuderen van deze interacties technisch uitdagend. Dit komt vooral omdat membraan-embedded receptoren amphipathisch zijn, waardoor ze moeilijk te isoleren zijn van biologische membranen voor biochemische manipulatie, en hun interacties worden gekenmerkt door de zwakke interactieaffinities(KDs in het μM-mM-bereik)1. Daarom zijn veelgebruikte methoden ongeschikt om deze klasse van eiwitinteracties1,2te detecteren .
Een reeks methoden is ontwikkeld om specifiek te onderzoeken extracellulaire receptor-ligand interacties die hun unieke biochemische eigenschappen in aanmerking nemen3. Een aantal van deze benaderingen omvatten het uitdrukken van het gehele ectodomein van een receptor als een oplosbaar recombinant eiwit in zoogdier- of insectcelgebaseerde systemen om ervoor te zorgen dat deze eiwitten posttranslationele wijzigingen bevatten die structureel belangrijk zijn, zoals glycanen en disulfidebindingen. Om de binding met lage affiniteit te overwinnen, worden de ectodomeinen vaak oligomeriseerd om hun bindingsbidheid te vergroten. Fervent eiwit ectodomains zijn met succes gebruikt als bindende sondes om interactiepartners te identificeren in directe recombinante eiwit-eiwit interactie schermen4,5,6,7. Hoewel in grote lijnen succesvolle, recombinante eiwitgebaseerde methoden vereisen dat het ectodomein van een membraanreceptor wordt geproduceerd als een oplosbaar eiwit. Daarom is het in het algemeen alleen van toepassing op eiwitten die een aaneengesloten extracellulaire regio bevatten (bijvoorbeeld single-pass type I, type II of GPI-verankerd) en is over het algemeen niet geschikt voor receptorcomplexen en membraaneiwitten die het membraan meerdere keren overspannen.
Expressie klonen technieken waarin een bibliotheek van complementaire SMA’s (cDNAs) wordt omgezet in cellen en getest op een gain-of-binding fenotype zijn ook gebruikt om extracellulaire eiwit-eiwit interacties te identificeren8. De beschikbaarheid van grote collecties gekloonde en gesequencede cDNA-expressieplasmids in de afgelopen jaren heeft methoden vergemakkelijkt waarbij cellijnen die cDNAs-coderingsceloppervlakreceptoren overdrijven, worden gescreend op de binding van recombinante eiwitten om interacties9,10te identificeren . De cDNA overexpression-gebaseerde benaderingen bieden, in tegenstelling tot recombinante eiwitgebaseerde methoden, de mogelijkheid om interacties in de context van het plasmamembraan te identificeren. Het succes van het gebruik van cDNA-expressieconstructies hangt echter af van het vermogen van de cellen om het eiwit in de juiste gevouwen vorm te overexpresseren, maar dit vereist vaak cellulaire accessoirefactoren zoals transporters, chaperonnes en correcte oligomeric assemblage. Het transfecteren van één cDNA is daarom misschien niet voldoende om een expressie van het celoppervlak te bereiken.
Screening technieken met behulp van cDNA constructies of recombinant eiwit sondes zijn resource-intensieve en vereisen grote collecties van cDNA of recombinant eiwit bibliotheken. Speciaal ontworpen massaspectrometrie gebaseerde methoden zijn onlangs gebruikt om extracellulaire interacties die niet vereisen de montage van grote bibliotheken te identificeren. Deze technieken vereisen echter chemische manipulatie van het celoppervlak, wat de biochemische aard van de moleculen op het oppervlak van de cellen kan veranderen en momenteel alleen van toepassing is op interacties die worden gemedieerd door glycosylated eiwitten11,12. De meerderheid van de momenteel beschikbare methoden ook sterk richten op de interacties tussen eiwitten, terwijl grotendeels het negeren van de bijdrage van het membraan micro-omgeving, met inbegrip van moleculen zoals glycanen, lipiden, en cholesterol.
De recente ontwikkeling van zeer efficiënte bialleleic targeting met behulp van CRISPR-gebaseerde benaderingen heeft genoom-schaal bibliotheken van cellen zonder gedefinieerde genen in een enkele pool die kan worden gescreend in een systematische en onpartijdige manier om cellulaire componenten die betrokken zijn in verschillende contexten te identificeren, inclusief het ontleden van cellulaire signaleringsprocessen, identificatie van verstoringen die resistentie tegen geneesmiddelen, toxines en ziekteverwekkers verlenen, en het bepalen van de specificiteit van antilichamen13,14,15,16. Hier beschrijven we een op genoomschaalfelijke CRISPR-gebaseerde knock-outcelscreeningtest die een alternatief biedt voor de huidige biochemische benaderingen om extracellulaire receptor-ligand interacties te identificeren. Deze benadering van het identificeren van interacties bemiddeld door membraanreceptoren door genetische schermen is bijzonder geschikt voor onderzoekers die een gerichte interesse hebben op individuele liganden, omdat het vermijdt de noodzaak om grote bibliotheken van cDNAs of recombinante eiwitten samen te stellen.
Deze test bestaat uit drie belangrijke stappen: 1) Zeer gretige recombinant eiwitbindingssondes bestaande uit de extracellulaire gebieden van een receptor van belang worden geproduceerd en gebruikt in fluorescentie-gebaseerde flow cytometrie gebaseerde bindende testen; 2) De bindende tests worden gebruikt om een cellijn te identificeren die de interactiepartner van de recombinant eiwitsonde uitdrukt; 3) Een Cas9-expressing versie van de cellijn die interageert met het eiwit van belang wordt geproduceerd en een genoom-schaal CRISPR / Cas9-gebaseerde knock-out scherm wordt uitgevoerd (Figuur 1). In dit genetische scherm wordt binding van een recombinant eiwit aan cellijnen gebruikt als meetbaar fenotype waarbij cellen binnen de knock-outbibliotheek die het vermogen hebben verloren om de sonde te binden worden gesorteerd met behulp van op fluorescentie gebaseerde geactiveerde celsorde (FACS) en de genen die het verlies veroorzaakten van het bindende fenotype dat door sequencing is geïdentificeerd. In principe worden de genen geïdentificeerd die de receptor coderen die verantwoordelijk is voor het binden van de fanatieke sonde en die welke nodig zijn voor het display van het celoppervlak.
De eerste stap van dit protocol omvat de productie van enthousiaste recombinante eiwitsondes die het ectodomein van de membraangebonden receptoren vertegenwoordigen. Van deze receptoren is bekend dat ze vaak hun extracellulaire bindingsfuncties behouden wanneer hun ectodomeinen worden uitgedrukt als een recombinant oplosbaar eiwit1. Voor een eiwit van belang, oplosbare recombinant eiwitten kunnen worden geproduceerd in een geschikte eukaryotische eiwit expressie systeem in elk formaat, op voorwaarde dat het kan oligomerized voor verhoogde binding avidity, en het bevat tags die kunnen worden gebruikt in fluorescentie-gebaseerde flow cytometrie gebaseerde bindende testen (bijvoorbeeld, FLAG-tag, biotine-tag). Gedetailleerde protocollen voor de productie van oplosbare ectodomeinen van membraanreceptoren met behulp van het HEK293-eiwitexpressiesysteem,evenalsverschillende multimerisatietechnieken en de eiwitexpressieconstructies voor de productie van zowel pentamerische eiwitten als monomeereiwitten zijn eerder beschreven 1,17. Het protocol hier zal beschrijven de stappen voor het genereren van fluorescerende enthousiaste sondes van monomerische biotinylated eiwitten door ze te conjugating tot streptavidin geconjugeerd tot een fluorchrome (bijvoorbeeld, fycoerythrin, of PE), die direct kan worden gebruikt in celgebaseerde bindende testen en heeft het voordeel van het niet vereisen van een secundaire antilichaam voor detectie. Algemene protocollen voor het uitvoeren van genoom-schaal schermen zijn al beschreven20,21, dus het protocol vooral gericht op de specifieke kenmerken van het uitvoeren van flow cytometrie-gebaseerde recombinant eiwit binding schermen met behulp van de CRISPR / Cas9 knock-out screening systeem met behulp van de Human V1 (“Yusa”) bibliotheek18.
Een CRISPR-gebaseerde screeningstrategie om genen te identificeren die cellulaire componenten coderen die betrokken zijn bij cellulaire herkenning wordt beschreven. Een soortgelijke aanpak met crispr-activering biedt ook een genetisch alternatief om direct interagerende receptoren van recombinanteiwitten te identificeren zonder dat grote eiwitbibliotheken hoeven te worden gegenereerd26. Echter, een groot voordeel van deze aanpak is dat het van toepassing is op interacties bemiddeld door oppervlaktemoleculen native weergegeven op de cel en is niet afhankelijk van de overexpressie van receptoren, die de bindende avidity van de receptor kan beïnvloeden. In tegenstelling tot andere methoden, daarom, deze techniek maakt geen veronderstellingen met betrekking tot de biochemische aard of celbiologie van de receptoren en biedt een kans om interacties bemiddeld door eiwitten die normaal gesproken moeilijk te bestuderen met behulp van biochemische benaderingen, zoals zeer grote eiwitten, of die het membraan meerdere keren doorkruisen of vormen complexen met andere eiwitten, en moleculen anders dan eiwitten zoals eiwitten zoals glycanen, glycolipids, en fosfolifoïden te bestuderen. Gezien de genoom-schaal aard van de methode, deze aanpak heeft ook het voordeel van niet alleen het identificeren van de receptor, maar ook extra cellulaire componenten die nodig zijn voor de bindende gebeurtenis, waardoor inzicht in de celbiologie van de receptor.
Een van de belangrijkste beperkingen van deze methode bij het gebruik ervan om de receptor van een weeseiwit te identificeren, is de eerste vereiste om eerst een cellijn te identificeren die zich bindt aan het eiwit. Dit is niet altijd eenvoudig en het identificeren van een cellijn die een bindend fenotype weergeeft dat ook tolerant is voor genetische schermen kan de tijdbeperkende stap zijn voor het implementeren van deze test. Sommige cellijnen hebben de neiging om te binden aan meer eiwitten dan anderen. Dit is vooral relevant voor eiwitten die GS binden, omdat deze eiwitten de neiging hebben om zich te binden aan elke cellijn die HS-zijketens weergeeft, ongeacht de oorspronkelijke bindingscontext. Daarnaast hebben we geconstateerd dat upregulatie van syndecanen (d.w.z. proteoglycanen die GS bevatten) in cellijnen leidt tot verhoogde binding van HS-bindende eiwitten26. Dit kan een factor zijn om rekening mee te houden bij het selecteren van de cellijn voor screening. Echter, ook belangrijk op te merken is dat de additieve binding van GS niet interfereert met de binding aan een specifieke receptor. Dit betekent dat als binding wordt nageleefd, het mogelijk is dat het uitsluitend door GS wordt bemiddeld omdat de binding die GS in deze test bemiddeld heeft, eerder additief is dan codeafhankelijk19. In een dergelijk scenario kan de beschreven heparineblokkeringsbenadering dergelijk gedrag identificeren zonder dat u een volledig genetisch scherm hoeft uit te voeren.
Een nuttige bron voor het kiezen van cellijnen is Cell Model Passport, die genomics, transcriptomics, en cultuur conditie informatie voor ~ 1.000 kanker cellijnen27bevat. Afhankelijk van de biologische context kunnen cellen worden gekozen op basis van hun expressieprofielen. Om de selectie van cellijnen te bevorderen, hebben we ~1.000 cellijnen geclusterd in Cell Model Passport volgens de expressie van ~1.500 vooraf geannoteerde menselijke celoppervlak glycoproteins28 (Aanvullende figuur 2; clusterinformatie voor elke cellijn samen met groeiomstandigheden zijn opgenomen in aanvullende tabel 2). Bij het testen van de binding van een eiwit met onbekende functie, is het nuttig om een paneel van representatieve cellijnen uit elk cluster te selecteren om de kans op het bedekken van een breed scala aan receptoren te vergroten. Gezien een keuze, is het raadzaam om cellijnen die gemakkelijk te cultuur en gemakkelijk te transduceren kiezen. Aangezien deze cellijnen zullen worden gebruikt in genoom-schaal screening, is het beter dat ze gemakkelijk kunnen worden geteeld in grote hoeveelheden en zijn tolerant voor lentivirale transductie, want het is de meest voorkomende methode voor de levering van sgRNA voor CRISPR-gebaseerde genetische screening in de latere stappen.
Over het algemeen worden de fenotypeselecties in één soort uitgevoerd. Dit wordt echter bepaald door de helderheid van de gekleurde celpopulatie in vergelijking met de besturing. Iteratieve selectierondes kunnen worden aangenomen voor scenario’s waarin de signaal-ruisverhouding van het gewenste fenotype laag is, of wanneer het doel van het scherm is om mutanten te identificeren die sterke fenotypes hebben. Bij het gebruik van een iteratieve selectiebenadering voor FACS-gebaseerde schermen is het belangrijk om te overwegen dat het sorteerproces celdood kan veroorzaken, voornamelijk als gevolg van de enorme kracht van de sorteerder. Zo zullen niet alle verzamelde cellen worden vertegenwoordigd in de volgende ronde van het sorteren.
De complexiteit van de bibliotheek is een zeer belangrijke factor bij het uitvoeren van succesvolle genetische schermen, vooral voor negatieve selectieschermen, omdat de mate van uitputting in deze schermen alleen kan worden bepaald door resultaten te vergelijken met wat er aanwezig was in de startbibliotheek. Voor negatieve selectieschermen is het gebruikelijk om bibliotheken met een complexiteit van 500-1.000 x te onderhouden. Positieve selectieschermen zijn echter robuuster voor bibliotheekgroottes, omdat in dergelijke schermen naar verwachting slechts een klein aantal mutanten voor een bepaald fenotype zal worden geselecteerd. Daarom kan in het hier beschreven positieve selectiescherm de grootte van de bibliotheek worden verlaagd tot 50-100x complexiteit zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van het scherm. Bovendien is het in deze schermen ook mogelijk om een controlebibliotheek voor een bepaalde cellijn op een bepaalde dag te gebruiken als een “algemene controle” voor alle monsters die op de dag voor die bepaalde cellijn zijn gesorteerd. Dit vermindert het aantal controlebibliotheken dat moet worden geproduceerd en gesequenced.
Een andere belangrijke overweging voor het gebruik van deze aanpak is de beperkingen van verlies-van-functie schermen bij het identificeren van genen die essentieel zijn voor in vitro cel groei. De timing van de schermen is daarbij cruciaal, naarmate hoe langer de gemuteerde cellen in de cultuur worden gehouden, hoe groter de kans dat cellen met mutaties in essentiële genen niet levensvatbaar worden en niet langer vertegenwoordigd zijn in de gemuteerde bibliotheek. De recente genetische schermen uitgevoerd als onderdeel van het Project Score initiatief in meer dan 300 cellijnen tonen aan dat meerdere genen in de KEGG-geannoteerde eiwitafscheiding en N-glycosylation traject vaak worden geïdentificeerd als essentieel voor een aantal cellijnen (Aanvullende figuur 3)29. Hiermee kan bij het ontwerpen van schermen rekening worden gehouden als het effect van genen die nodig zijn voor proliferatie en levensvatbaarheid moet worden onderzocht in het kader van het cellulaire herkenningsproces. In dit geval zou het in het algemeen passend zijn om schermen in een vroeg tijdstip uit te voeren (bijvoorbeeld dag 9 na de transmissie). Als de aanpak echter wordt gebruikt om een paar doelen met sterke grootteeffecten te identificeren in plaats van algemene cellulaire trajecten, kan het passend zijn om schermen op een later tijdstip uit te voeren (bijvoorbeeld dag 15-16 na de transmissie).
De resultaten van de screening zijn zeer robuust; in acht recombinant eiwitbindingsschermen die in het verleden werden uitgevoerd, was de celoppervlakreceptor de hoogste hit in elk geval19. Bij het gebruik van deze benadering om de interactiepartner te identificeren, moet men daarom verwachten dat de receptor en de factoren die bijdragen aan de presentatie op het oppervlak worden geïdentificeerd met een hoog statistisch vertrouwen. Zodra het scherm is uitgevoerd en een hit wordt gevalideerd met behulp van een enkele gRNA knock-out, verdere follow-ups kunnen worden uitgevoerd met behulp van bestaande biochemische methoden zoals AVEXIS4 en directe saturable binding van gezuiverde eiwitten met behulp van oppervlakte plasmon resonantie. De hier beschreven aanpak is toepasbaar voor alle eiwitten waarvoor het mogelijk is om een oplosbare recombinant bindingssonde te genereren.
Samengevat is dit een genoom-schaal CRISPR knock-out benadering om interacties te identificeren bemiddeld door celoppervlakte eiwitten. Deze methode is over het algemeen van toepassing om cellulaire paden te identificeren die nodig zijn voor celoppervlakkenherkenning in een breed scala van verschillende biologische contexten, waaronder tussen de eigen cellen van een organisme (bijvoorbeeld neurale en immunologische herkenning), evenals tussen gastheercellen en pathogene eiwitten. Deze methode biedt een genetisch alternatief voor biochemische benaderingen ontworpen voor receptor identificatie, en omdat het geen voorafgaande veronderstellingen met betrekking tot de biochemische aard of celbiologie van de receptoren vereist, heeft het een groot potentieel om volledig onverwachte ontdekkingen te doen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Wellcome Trust subsidienummer 206194 toegekend aan GJW. Wij danken de Cytometry Core faciliteit: Bee Ling Ng, Jennifer Graham, Sam Thompson, en Christopher Hall voor hulp met FACS.
Anti-mouse alkaline phosphatase | Sigma | A4656 | |
Blasticidin | Chem-Cruz | SC-204655 | |
Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit | Qiagen | 13362 | |
BSA | Sigma | A9647-100G | |
Diethanolamine | Sigma | 398179 | |
DMEM | Gibco | 31966-021 | |
Dneasy Blood and Tissue kit | Qiagen | 69504 | |
DynaMag-96 Side Magnet | Invitrogen | 12331D | |
HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | |
Heparin | Sigma | H4784-1G | |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa | KK2602 | |
Lipofectamine LTX with PLUS reagent | Invitrogen | 15338100 | |
MoFlo XDP cell sorter | BD | ||
Ni2+-NTA agarose beads | Jena Bioscience | AC-501-25 | |
OPTI-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
OX-68 antibody | AbD Serotec | MCA1022R | |
p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 1040-506 | |
PD-10 desalting columns | GE healthcare | 17085101 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
Polypropylene tubes with 5 mL bed volume | Qiagen | 34964 | |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 3115879001 | |
Puromycin | Gibco | A11138-03 | |
Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix | NEB | M0494L | |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
SCFA filter | Nalgene | 190-2545 | |
Sony Cell sorter | Sony | ||
SPRI beads (Agencourt AMPure XP beads) | Beckman | A63881 | |
Streptavidin-coated microtitre plates | Nalgene | 734-1284 | |
Streptavidin-PE | Biolegend | 405204 |