Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.
Proteinlerin birden fazla çeviri sonrası modifikasyonları (PtM) eğitimi PTM crosstalk anlamak ve protein fonksiyonu içine daha bütünsel anlayışlar kazanmak için önemli bir adımdır. Çok PTM zenginleştirme çalışmalarının önemine rağmen, ptm’lerin birden fazla küresel proteomik analizini gerçekleştirmek için gereken harcamalar, zaman ve büyük protein miktarları nedeniyle, aynı anda birden fazla PTM araştırmak birkaç çalışma. Bu protokolde ayrıntılı olarak yer alan “tek pot” yakınlık zenginleştirme, peptidlerin eşzamanlı olarak tanımlanmasına ve ölçülmesiile, düşük miktarda numune içeren lizin kalıntıları ve süksinyon PTM’leri ile bu engelleri aşarak aşar. Giriş. Protokol, SIRT5 nakavt farelerin fare karaciğerlerinden protein lisatının hazırlanmasını, tripsin sindiriminin ifasını, PtM’ler için zenginleştirmeyi ve veribağımsız bir kazanım (DIA) iş akışı kullanarak kütle spektrometrik analizinin gerçekleştirilmesini içerir. Bu iş akışı aynı örnekten aynı anda iki PTM zenginleştirme sağlar, bu örnek büyük miktarlarda gerek kalmadan PTM crosstalk çalışma için pratik bir araç sağlar ve büyük ölçüde örnek hazırlanması için gerekli süreyi azaltır, veri edinimi ve analizi. İş akışının DIA bileşeni kapsamlı PTM’ye özgü bilgiler sağlar. DIA, farklı PTM yerelleştirme izoformlarını ayırt etmek için hesaplama lı olarak deşifre edilebilen kapsamlı parça iyonları setleri sağladığından, PTM site yerelleştirmesini incelerken bu özellikle önemlidir.
Çok sayıda çeviri sonrası modifikasyon, proteinleri ve yolları aktivite1,sinyalizasyon2ve ciro3,4üzerindeki etkilerle dinamik olarak düzenler. Örneğin, protein kinazları fosfat grupları5ilavesi ile aktive edilir veya devre dışı bırakılır ve histon asetilasyon ve diğer modifikasyonlar kromatin yapısını değiştirmek için bir mekanizma sağlar ve transkripsiyonel düzenleyici mekanizmalar olarak hizmet vermektedir6,7. Son yıllarda, kanıt birden fazla PTM konser de çalışmak ya da protein fonksiyonu veya aktivitesi8,9,10,11düzenlemek için rekabet monte edilmiştir. Bu nedenle, PTM crosstalk anlamak PTM araştırma ortaya çıkan bir ihtiyaçtır. Ancak, PTM sitelerini tanımlamak ve ölçmek için mevcut proteomik iş akışlarının çoğu, birden çok değişikliğin etkileşimi yerine tek değişikliklere odaklanır. Açıklanan iş akışı, birden fazla farklı PtM tarafından modifiye edilen spesifik protein modifikasyonu “sıcak noktalar” ve lizin artıklarını ilişkilendirir.
Aynı anda birden fazla PTM’leri incelemek için uygulanabilir yöntemler için bilim camiasında artan bir ihtiyaç vardır12. Küresel olarak belirlemek ve PTM birden fazla türde siteleri ölçmek için en yöntemleri yüksek maliyet ve doku miktarı nedeniyle12,13gerekli zor . Sadece çok PTM zenginleştirme deneyleri örnek hazırlama, veri toplama ve veri analizi açısından zaman alıcı, ancak bu çalışmalar genellikle protein büyük ve genellikle engelleyici miktarda gerektirir11. Burada açıklanan aynı anda zenginleştirme ve birden fazla PTM analizi için bir protokol, aynı zamanda bu engellerin birkaç adresleri ve büyük ölçekli PTM profilleme sağlar ve çeşitli PTM’ler arasında çapraz konuşma değerlendirme14. Bu bir-pot iş akışı biyomedikal araştırmacılar için pratik bir yol özetliyor küresel birden fazla PTMs profil, co-modifiye peptidler tanımlamak, ve verimli ve maliyet-etkin bir şekilde PTM crosstalk çalışma14,15.
Burada, bu yöntem ilk 50 yıl önce16üzerinde çalışıldı mitokondriyal protein aylasyonu inceleyerek sergilenir. Özellikle lizin asetilasyon17 ve süksinilasyon18üzerinde yoğunlaşmıştır , proteinler ve hatta peptid düzeyinde co-modifikasyon bu değişikliklerin birlikte oluşumu da dahil olmak üzere. Çalışma da sirtuin 5 (SIRT5) nakavt fare modeli kullandığından, asetilasyon ve süksinilasyon alanlarının zenginleşmesine odaklanmak için seçilmiştir. Bu karar, kısas ilasyon alanlarının SIRT5 desuccinylase’nin hedefi olması ve bu nedenle KO farelerde önemli bir düzenleme göstermesi nin beklendiği için alınmıştır. Her iki PTMs biyolojik olarak son zamanlarda Carrico ve ark.19tarafından özetlenen ilgilidir. Genel olarak, asetilasyon gen ekspresyonu ve metabolizması üzerinde önemli etkileri gösterir, ve succinylation kalp metabolizması ve fonksiyon düzenlemek için bildirilmiştir20.
Açıklanan protokol, düşük miktarda protein girdi materyali (örn. 1 mg protein lisat) ile gerçekleştirilebilir ve numune işleme, MS alımı ve veri analizi için harcanan süreyi azaltarak deneyin toplam süresini kısaltabilir. Şekil 1’debir iş akışı şeması verilmiştir. Ayrıca daha da düşük miktarlarda başlangıç materyali (100 μg’a kadar protein lisat, buna göre kullanılan boncuk miktarlarını azaltarak) kullandık ve bu da beklendiği gibi tanımlanmış acylated peptidlerin toplam verimini azaltıyor; ancak, hala son derece değerli sonuçlar ve ölçülebilir acylated peptidler sağlar.
Yukarıdan aşağıya veya orta aşağı iş akışları genellikle proteolitik sindirim yaklaşımları kullanmazken (ve böylece tek bir protein içinde birden fazla PtM’nin bağlantısını korurken), bu protokol PTM tanımlama ve nicelleştirme için ekstra derinlik ve duyarlılık kazanmak için peptid bazlı afinite zenginleştirme yaklaşımına odaklanır (Şekil 1). Buna ek olarak, bu peptit merkezli iş akışı, 1) spektral kitaplıklar oluşturmak için veriye bağımlı kazanım (DDA) kombinasyonu ve etiketsiz bir iş akışında doğru PTM niceliği için 2) veri bağımsız kazanım (DIA) dahil olmak üzere modern kütle spektrometresi yöntemlerikullanır.
DIA iş akışları, örneklenmiş m/z aralığı21’dekitüm peptit sinyallerini kapsamlı bir şekilde parçalayarak tipik DDA taramalar›n› n› örnekleme stochasticity’nin üstesinden gelecektir. Bu özellik, hangi belirli parça iyonlarının peptid içinde değiştirildiğine ilişkin bilgi edinmek daha kolay olduğundan, site lokalizasyonu açısından da son derece yararlıdır. Buna ek olarak, DIA iş akışları özdeş öncül iyonları ile küçük PTM-peptid isoformların tanımlanması ve nicelleştirilmesine olanak sağlar. DIA yöntemleri de kapsamlı her zaman ölçülen belirli karşılık gelen parça iyonları dayalı bir peptid içinde belirli bir PTM site lokalizasyonu belirleyebilirsiniz. Ancak, DDA yaklaşımları genellikle aynı öncül iyon için MS/MS örneklemesini dışlayan ve böylece küçük PTM isoformlarını kaçıran “dinamik dışlama” özelliklerini kullanır.
Burada açıklanan eşzamanlı zenginleştirme stratejisi, birden fazla PTM’nin küresel profilleme ve sayısallaştırılmasından, PTM çapraz konuşmasının incelenmesinden ve çeviri sonrası modifikasyonların dinamik etkileşimlerinin anlaşılmasından yararlanacak çalışmalar için idealdir. Tek bir kombine iş akışında birden fazla zenginleştirilmiş PTM’nin tanımlanması şu şekilde tanımlanmıştır: proteolitik peptidler içeren PTM’nin küresel, seri veya paralel zenginleştirilmesi veya alternatif olarak bozulmamış proteinlerin analizi. Asetiles ve süksinir seri zenginleştirme ile doğrudan karşılaştırıldığında, tek pot metodolojisinin verimliliği çok benzer14olarak kurulmuştur. Bu alternatif protokoller önemli miktarda başlangıç malzemesi ve zaman gerektirir ve son derece pahalı olabilir. Buna karşılık, tek pot protokolü sonraki analiz ve tanımlama ile birden fazla PTM zenginleştirme için ucuz ve verimli bir yöntem sağlar.
Fare karaciğer dokuları SIRT5 nakavt farelerden elde edilir ve burada başlangıç malzemesi olarak kullanılır. Bu protokol aynı zamanda farklı dokulardan veya hücre kültürü deneylerinden protein lisatları için de yapılabilir. Bu protokol dokulardan veya hücre kültürü peletlerinden elde edilen protein lisatlarına uygulanabilir.
Bu protokol, PTM çapraz konuşmasını daha etkili bir şekilde anlamak için eşzamanlı çoklu PTM zenginleştirme için yeni bir tekniği açıklar. Bu amaca ulaşmanın alternatif yöntemleri engelleyici zaman alıcı ve pahalı olma eğilimindedir, ve başarılı olmak için protein büyük miktarda gerektirir11,13. Bu protokol, deneyin genel verimliliğini artırmak için aynı anda iki PTM için antikor konjuge boncuklarda kuluçka içeren çok PTM zenginleştirme iş akışı sunar. Bu yöntem aynı zamanda spektral kütüphane üretimi ve DIA MS kazanımları için DDA kullanımını tespit etmek ve parça iyonları22,23azaltılmış girişim ile mevcut peptidler ölçmek içerir. MS veritabanı arama motorları gibi yazılım programları DDA satın almalarından elde edilen verileri analiz etmek ve ölçmek için kullanılırken, Kantitatif Proteomik Yazılım24 ve dia satın almaları tarafından üretilen karmaşık spektrumları yorumlamak için özel DIA Kantitatif Analiz Yazılımı25 gereklidir.
Bu protokol içinde dikkatle izlenmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Protokolün ana amacı aynı anda birden fazla PtM için zenginleştirmek olduğundan, antikor-yakınlık zenginleştirme adımı (bölüm 2) deneyin başarısı için önemlidir. Boncuklar üzerinde yıkıntı yaparken, boncukların hiçbirinin kazara aspire edilmemesini sağlamak gerekir. Üre konsantrasyonunun sindirimden önce 1 M’ye kadar seyreltilmesini sağlamak tripsin (adım 1.8) ile de gereklidir. Protein çözünürasyonu için protokolde daha önce 8 M üre gerekmesine rağmen, 1 M’nin üzerindeki üre konsantrasyonları tripsinin enzimatik aktivitesini inhibe edecektir. Buna ek olarak, protokol boyunca numunenin pH’ını sürekli olarak kontrol etmek önemlidir. Bu özellikle sindirim öncesinde önemlidir. Numunenin pH’ı ve tripsin çözeltisi kuluçkadan önce uygun şekilde nötralize edilmezse, birçok dekolte bölgesinde gözden kaçırılabileceği ve daha az peptid tanımlaması ile sonuçlanabileceği verimsiz bir sindirime neden olabilir.
Örnekler hazırlanırken protokolde yapılan birkaç değişiklik yararlı olabilir. 1 mg başlangıç materyalinden elde edilen bir protein lisat için, her PTM tarar tüpünde sağlanan antikor boncuklarının dörtte biri uygun maliyetli bir alternatif olarak kullanılabilir. Kullanılan antikor boncuk miktarı orantılı olarak arttığı sürece, daha iyi sonuçlar için daha fazla sayıda başlangıç malzemesi kullanılabilir. İş akışını geliştirebilecek bir diğer değişiklik de, örnekleri tripsinin ek olarak başka bir proteaz ile sindirmektir. Bu modifikasyon, protein kalıntılarının daha fazla kapsama alanı sağlayarak, kümeslerde daha fazla değişkenliğe neden olur. Gerekli olmamakla birlikte, yüksek dekolte özgüllüğü nedeniyle PTM analizinde kullanılan enzimlerden biri olan tripsinin olması tavsiye edilir26.
Bu protokolün bir sınırlama sıyrık, çalışılan PtM’lerin aynı anda zenginleşebilmesi için benzer kimyalara sahip olması gerektiğidir14. Farklı antikor konjuge boncuklar için prosedürler benzer olmalıdır, benzer elüsasyon koşulları da dahil olmak üzere benzer çözücüler ve çözümler kullanarak, ve tercihen aynı satıcıdan. Bu nedenle, burada özetlenen yöntem sürekli bir örnek olarak asetilasyon ve süksinyas kullanır, her ikisi de antikor konjuge boncuklar kullanın (Hücre Sinyal Teknolojisi, Inc). Bu yöntem teorik olarak herhangi bir sayıda PtM’ye uygulanabilmesine rağmen, protokolün bu konudaki tam sınırlamasını değerlendirmek için ek çalışmalara ihtiyaç olacaktır. Ayrıca, bu bir antikor tabanlı zenginleştirme yöntemi olduğu gibi, yöntem sadece PTM sitelerinin göreceli bir nicel sağlayabilir.
Mevcut çoklu PTM zenginleştirme yöntemleriile karşılaştırıldığında, bu iş akışı daha uygun ve uygun maliyetli bir alternatiftir. Bu deneyden, bu yöntemin etkinliğinin bireysel veya seri zenginleştirmeler gibi alternatif yöntemlerle son derece iyi karşılaştırıldığında olduğu gözlenmiştir. Şekil 2B, modifiye peptid pik alanları için ortanca CV aslında tek PTM zenginleştirmeler ve seri-PTM zenginleştirmeler13göre tek pot yöntemi azalmıştır gösterir. Ayrıca asetilasyon veya süksinilasyon için site düzeyinde ki nicelikleri değerlendiren deneysel sonuçları analiz ettik. Ayrıca, Spearman korelasyon analizi(Şekil 2C,D)tek potluk PTM zenginleştirme tek PTM zenginleştirme iş akışları benzer performans gösterdi. Bu aynı zamanda peptid ve parça düzeyinde korelasyonlar için de geçerliydi. Seri-PTM zenginleştirme ile bir-pot karşılaştırırken her üç korelasyon için yapılan aynı gözlem.
Bu protokol, araştırmacıların PTM crosstalk’a hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde büyüleyici biyolojik bilgiler edinmelerini sağlar. İş akışının DIA bileşeni araştırmacıların PTM’ler hakkında daha fazla bilgi sağlamasına olanak sağlar, çünkü site lokalizasyonu hakkında bilgi sağlar ve PTM’lerin düşük site doluluk oranı gibi zorlukların üstesinden gelmektedir. Bu yöntem kullanılarak aynı anda kaç PtM’nin zenginleştirilebildiğini değerlendirmek için takip deneyleri yapılabilir. Bu iş akışının gelecekteki bir iyileştirme daha fazla site yerelleştirme ve PTM site doluluk analizini otomatikleştirmek için daha gelişmiş yazılım platformları geliştirilmesi içerebilir.
The authors have nothing to disclose.
Buck Enstitüsü’ndeki (1S10 OD016281) TripleTOF sistemi için NIH ortak enstrümantasyon hibesinin desteğini kabul ediyoruz. Bu çalışma ayrıca Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (R01 AI108255-B.S.) ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (R24 DK085610, Eric Verdin; R01 DK090242 Eric Goetzman için). X.X. Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH hibe T32GM8806, Judith Campisi ve Lisa Ellerby için) bir hibe tarafından desteklenen, NB Glenn Vakfı Tıbbi Araştırma için doktora sonrası burs tarafından desteklendi.
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |