Nous présentons une méthode qui combine la purification et la reconstitution de protéine de membrane en peptidiscs en une seule étape chromatographique. Les échafaudages biotinylated sont employés pour l’attachement direct de surface et la mesure des interactions protéine-ligand par l’intermédiaire de l’interférométrie de biocouche.
Les protéines membranaires, y compris les transporteurs, les canaux et les récepteurs, constituent près d’un quart du protéome cellulaire et plus de la moitié des cibles actuelles des médicaments. Pourtant, un obstacle majeur à leur caractérisation et leur exploitation dans les milieux académiques ou industriels est que la plupart des stratégies biochimiques, biophysiques et de dépistage des médicaments exigent que ces protéines soient dans un état soluble dans l’eau. Notre laboratoire a récemment mis au point le peptidisc, un mimétique membranaire offrant une approche « universelle » au problème de la solubilité des protéines membranaires. Nous présentons ici un protocole simplifié qui combine la purification des protéines et la reconstitution peptidisc en une seule étape chromatographique. Ce flux de travail, appelé PeptiQuick, permet de contourner la dialyse et l’incubation avec des perles de polystyrène, réduisant ainsi considérablement l’exposition au détergent, la dénaturation des protéines et la perte d’échantillons. Lorsque PeptiQuick est effectué avec des échafaudages biotinylated, la préparation peut être directement attachée aux surfaces enduites de streptavidin. Il n’est pas nécessaire de biotinylate ou de modifier la cible de protéines membranaires. PeptiQuick est présenté ici avec le récepteur membranaire FhuA et la colicine ligand antimicrobienne M, en utilisant l’interférométrie biocouche pour déterminer la cinétique précise de leur interaction. Il est conclu que PeptiQuick est un moyen pratique de préparer et d’analyser les interactions protéines-ligand membrane en un jour dans un environnement sans détergent.
Les protéines membranaires sont souvent exclues des programmes de recherche sur la découverte de médicaments ou d’anticorps en raison de la propension des protéines membranaires à s’agréger à l’extérieur de l’environnement bicouche lipidique, en particulier en présence de détergents1. Par conséquent, ces dernières années, plusieurs mimétiques membranaires (appelés échafaudages) ont été développés pour faciliter l’isolement et l’interrogatoire des protéines membranaires dans un environnement complètement sans détergent (c.-à-d. nanodisques, SMALPs, amphipols, etc.) 2,3,4,5,6. Cependant, la reconstitution des protéines membranaires dans ces mimétiques nécessite souvent une optimisation étendue, qui prend beaucoup de temps et s’accompagne généralement d’une perte de récupération des protéines7,8. Pour surmonter ces limites, notre laboratoire a récemment mis au point une formulation « universelle » connue sous le nom de peptidisc9. Le peptidisc se forme lorsque plusieurs copies d’un peptide biphélical amphipathique de 4,5 kDa se lient à la surface hydrophobe d’une protéine membranaire cible. La reconstitution stable dans le peptidisc se produit sur l’enlèvement du détergent, attachant des lipides endogènes et des protéines solubilisées de membrane dans les particules solubles dans l’eau. Ces particules stabilisées sont maintenant propices à de nombreuses applications en aval.
La méthode peptidisc offre plusieurs avantages; par exemple, la reconstitution est simple, puisque la liaison de l’échafaudage peptidique sur la cible est guidée par le modèle de protéine lui-même9,10. La stoichiométrie peptidique est également autodéterminée, et l’ajout de lipides exogènes n’est pas nécessaire. La formation de peptidisc se produit par la dilution simple de détergent, un avantage important sur la dialyse ou l’adsorption sur des perles de polystyrène, qui ont souvent comme conséquence le bas rendement de protéine dû à l’association et à l’agrégation de surface non spécifiques11,12 ,13. L’assemblage final du peptidisque est très thermostable et invariablement soluble dans différents tampons ou en présence de cations divalentes (p. ex., Ni2). La pureté et l’homogénéité structurelle de l’échafaudage sont également élevées (p. ex., sans endotoxine), et le peptide peut être personnalisé avec des groupes fonctionnels placés à des positions différentes.
Nous présentons ici un workflow de laboratoire appelé PeptiQuick, également connu sous le nom de reconstitution sur les perles9. Ce protocole combine la purification des protéines membranaires et la reconstitution peptidisc en une seule étape et sur le même support chromatographique. Comme son nom l’indique, PeptiQuick est rapide par rapport à d’autres méthodes de reconstitution, et il réduit également sérieusement le temps d’exposition au détergent. Les effets détergents négatifs tels que le développement et l’agrégation des protéines se produisent souvent d’une manière dépendante du temps; par conséquent, il est essentiel de minimiser l’exposition aux détergents pour maintenir la conformation protéique indigène14,15. Ceci est crucial pour l’exactitude des méthodes qui rendent compte des interactions protéiques et des affinités liant ligand.
Tout en développant ce protocole, nous présentons la nouvelle version biotinylated de l’échafaudage peptidisque, appelé Bio-Peptidisc. Les groupes fonctionnels de biotine permettent l’attachement de la protéine de membrane cible sur les surfaces streptavidin-enduites. Étant donné que l’étiquetage de la biotine est limité à l’échafaudage, les sites de liaison sur la protéine membranaire cible demeurent inchangés. À l’aide du Bio-Peptidisc, la cinétique de liaison du récepteur de membrane bactérienne FhuA et de la colicine de peptide antimicrobienne M (ColM) sont déterminées16. Cette affinité est mesurée par interférométrie biocouche (BLI), qui analyse les interactions en temps réel en fonction des modèles d’interférence de la lumière blanche réfléchis à partir d’une pointe du capteur.
En utilisant ce protocole, le besoin de détergent lors de l’analyse BLI est éliminé, ce qui est un développement important, car les détergents peuvent perturber les interactions. Les affinités de liaison peuvent être mesurées rapidement avec cette méthode, et les résultats sont comparables à ceux rapportés plus tôt en utilisant des nanodisques et la calorimétrie de titration isothermale (ITC)16. Les étapes critiques du flux de travail PeptiQuick sont montrées et discutées, telles que la préparation des protéines, la dilution des détergents, l’addition de peptide et la reconstitution, ainsi que des conseils pour dépanner le ligand et la liaison analyte dans l’analyse BLI. En utilisant le flux de travail PeptiQuick, il est constaté que les protéines membranaires peuvent être capturées dans les peptidisques et leurs interactions mesurées dans une journée.
Tandis que les détergents restent la méthode la plus simple pour extraire et purifier les protéines membranaires, ces surfactants peuvent avoir beaucoup d’effets indésirables sur la stabilité de protéine, la fonction, et les analyses en aval1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Ces difficultés ont motivé le développement de mimétiques membranaires, qui s’efforcent de minimiser la présence de détergents et de reproduire l’environnement membranaire indigène autant que possible2,3,4 ,5,6. La majorité des méthodes de reconstitution, cependant, nécessitent une optimisation significative des conditions de reconstitution et nécessitent souvent des étapes de purification supplémentaires, qui diminuent le rendement final7,8. Le peptidisque s’adapte spontanément à la protéine membranaire cible et, comparativement, nécessite peu d’optimisation et de purification en aval9,10. Dans ce protocole, PeptiQuick est présenté comme un moyen simple de rationaliser le protocole de reconstitution pour l’analyse d’interaction protéine-protéine en aval.
Bien que simples, il existe plusieurs mises en garde expérimentales qui peuvent conduire à une reconstitution infructueuse. Parmi ceux-ci, le plus commun est dû à l’agrégation de protéine. Il est donc essentiel d’effectuer une chromatographie d’exclusion de taille pour surveiller le processus de reconstitution. Par exemple, un pic d’exclusion de taille élutant au volume vide est indicatif des agrégats de protéines (Figure 3B)17,18. Les agrégats de protéines membranaires se forment généralement lors d’une exposition prolongée à des conditions détergentes sous-optimales avant la reconstitution. En particulier, il a été constaté que les protéines membranaires dans le détergent ont tendance à former des agrégats lorsqu’elles sont concentrées par ultrafiltration sur des dispositifs centrifuges. Dans ce cas, les protéines membranaires sensibles peuvent être concentrées à l’aide de l’ultra-filtration sous vide, une méthode de concentration plus douce et plus homogène puisque l’adsorption des protéines au filtre est diminuée.
En général, pour éviter la concentration de protéines, les fractions IMAC éluées doivent être mises en commun, et un aliquot injecté sur une colonne d’exclusion de taille pour vérifier sa qualité de reconstitution. Il convient de noter que les élutes de peptide libre non incorporées juste après le pic peptidisque principal (figure 3B). L’échafaudage libre n’entrave pas nécessairement les expériences en aval. Cependant, si nécessaire, cet excès peut être enlevé par la chromatographie d’exclusion de taille. Alternativement, l’augmentation du volume de lavage pendant la reconstitution, et avant l’élution de la résine IMAC, est suffisante pour enlever efficacement la plupart du peptide libre. Par conséquent, la chromatographie d’exclusion de taille est recommandée comme moyen rapide et simple de vérifier la qualité de reconstitution.
L’expérience BLI nécessite une optimisation minutieuse des concentrations de ligands et d’analytes. La liaison Ligand doit être suffisante pour obtenir un signal clair, mais la surcharge entraînera la saturation du signal, ce qui entraîne des artefacts de données du surpeuplement et de l’obstacle stérilisé sur la surface de pointe. Par conséquent, la concentration du ligand et la durée du temps que la pointe passe dans la solution ligand doivent être optimisées pour chaque échantillon de protéines(figure supplémentaire 2). La concentration d’analytes doit également être optimisée. Si la constante de dissociation est connue, cette étape devient plus facile, puisque la plage de concentration peut être approximative. Un bon point de départ pour cette analyse est d’utiliser des concentrations de protéines entre 0,1 et 20 fois le Kdprévu 19.
Après l’acquisition de données BLI, une analyse minutieuse des données doit être effectuée pour éviter toute mauvaise interprétation. Le calcul de la constante de dissociation dépend de l’ajustement d’une courbe de liaison. À moins que la stoichiométrie de liaison soit déjà connue, un modèle classique d’interaction bimoléculaire 1:1 devrait être employé pour l’ajustement initial. Il convient de noter qu’une courbe de liaison hétérogène est souvent le résultat d’artefacts et d’un comportement non idéal causé par une forte concentration d’analytes, qui peut être mal interprétée comme un modèle de liaison complexe. Par conséquent, l’abaissement de la concentration d’analytes jusqu’à ce que le profil sensorgram affiche 1:1 stoichiométrie de liaison peut aider à différencier la liaison hétérogène des interactions plus complexes. Toutes les données de liaison hétérogènes résiduelles sont ensuite actualisées comme le montre la figure 420.
Dans ce rapport, une constante de dissociation de 2,28 à 0,74 nM pour l’interaction FhuA-ColM est mesurée. Cette valeur est compatible avec la constante de dissociation précédemment déterminée dans notre groupe avec nanodisque ou peptidisque utilisant ITC ou MST, respectivement (Figure 4E)16. Cette cohérence donne confiance sur la reconstitution peptidisc et l’analyse BLI comme un moyen de déterminer la cinétique interaction. Fait important, il convient de noter que les protéines sont généralement immobilisées sur les biocapteurs de streptavidin soit par biotine chimique cross-linking ou l’ajout spécifique au site en utilisant la transtin e. coli ligaseBirA 21. De toute évidence, la biotinylating de l’échafaudage peptidisque, au lieu de la protéine de membrane cible, a beaucoup d’avantages. La biotinylation des échafaudages permet de gagner du temps et de réduire au minimum le risque de perturber d’importants sites de liaison protéique. Nous avons également constaté que PeptiQuick s’applique à un large éventail de classes cibles protéiques, y compris les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR), les canaux ioniques et les protéines membranaires des barils d’Ile-de-France. En général, il convient de noter que l’extrait détergent initial des protéines membranaires dans un état exempt d’agrégats est essentiel, et que la reconstitution immédiate en peptidisc diminue les problèmes d’agrégation en aval. Compte tenu de la simplicité, il est prévu que PeptiQuick sera étendu à d’autres essais de liaison à base de streptavidin, tels que la résonance plasmon de surface (SPR), essais ELISA, et l’affinité pull-downs en utilisant des perles de streptavidin.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada. JS détient une bourse d’études des IRSC de la SCG-M. LT a reçu l’appui du Partenariat de formation doctorale en biosciences du Sud-Ouest financé par le Conseil des biotechnologies et des sciences biologiques [référence de la subvention de formation BB/M009122/1]. FD est titulaire d’une chaire de recherche du Canada de niveau II.
30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | – |
Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | – |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | – |
Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | – |
Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | – |
Protein Assay Dye – Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration – 5x concentration |
Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | – |
Thiamine | Merck | 69271 | – |
Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | – |