Scheiding van de celenvelop voor gramnegatieve bacteriën in binnen- en buitenste membraanfracties met technische aanpassingen voor Acinetobacter baumannii

Gram-negatieve bacteriën produceren twee membranen die worden gescheiden door een periplasmische ruimte en een peptidoglycan celwand¹. Het binnenste membraan (IM) omhult de cytosol en is een symmetrische tweelaag van fosfolipiden. Peptidoglycan beschermt tegen turgordruk en voorziet de bacterie van een celvorm en is bevestigd aan het buitenste membraan (OM) door lipoproteïnen^2,3. Het OM omringt het periplasma en is overwegend asymmetrisch. De binnenste bijsluiter bestaat uit fosfolipiden en de buitenste bijsluiter bestaat uit glycolipiden bekend als lipooligosachariden (LOS) of lipopolysachariden (LPS)^4,5. De lipideasymmetrie en de biochemie van de LOS/LPS-moleculen in de buitenste bijsluiter geven barrière-eigenschappen aan het celoppervlak die de bacterie beschermen tegen gevaren in zijn omgeving^6,7.

LPS moleculen bestaan uit drie bestanddelen: de lipide A disaccharolipide, de kern oligosaccharide, en de O-polysaccharide of O-antigeen. Lipide A is een vermenigvuldig acylated disaccharolipide. Core-oligosachariden bestaan uit 10-15 suikers die bekend staan als ruwe LPS of R-LPS. De kern is onderverdeeld in het binnenste gebied, samengesteld uit 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonzuur (kdo) en een of meer heptoseresiduen, en een buitengebied dat over het algemeen bestaat uit hexoses (glucose of galactose) en heptoses, of paracetamolsuikers⁵. Het buitenste kerngebied is variabeler in zijn componenten en structuur dan de binnenste kern. In Salmonella spp., slechts een kernstructuur is beschreven; echter, in Escherichia coli zijn er vijf verschillende kernstructuren (aangewezen K-12, R1, R2, R3, en R4)⁸. E. coli K-12 DH5α, die we gebruiken in deze procedure draagt een mutatie die resulteert in de productie R-LPS⁹. De R-LPS moleculen missen de O-antigeen moiety en hebben een vergelijkbaar moleculair gewicht als LOS moleculen.

De toevoeging van O-antigeen aan R-LPS maakt van dit molecuul een gladde LPS, of S-LPS. De O-antigenen zijn opgebouwd uit korte 3-4 koolhydraatsubeenheden en bestaan uit meerdere modaliteiten met verschillende ketenlengtes^10. Sommige LPS-producerende bacteriën, zoals Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), tonen een trimodale verdeling van LPS moleculen op hun oppervlak^10,11. Zeer lange keten O-antigenen kunnen meer dan honderd subeenheden bevatten en meer dan honderd kilodaltons wegen. De O-antigenen bieden oppervlakte-eigenschappen aan de bacterie die nodig zijn om antibiotica te weerstaan, predatie te ontwijken door bacteriofagen en ziekte te veroorzaken.

Soorten Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria en anderen genereren LOS moleculen in plaats van LPS moleculen op hun oppervlak¹². LOS moleculen bestaan uit lipide A en kern oligosachariden, maar missen het O-antigeen. Deze soorten gramnegatieve bacteriën wijzigen hun kernoligosachariden met extra suikers en combinaties van suikers om de oppervlakte-eigenschappen te veranderen¹². Zowel LOS als LPS-producerende microben derivatize de fosfaten op lipide A en kernmoleculen met kationische moieties⁷. Deze toevoegingen omvatten fosfoethanolamine, galactosamine en aminoarabinose substitutie, die functioneren door het neutraliseren van anionische oppervlakte lading en daarmee te beschermen tegen kationische antimicrobiële peptiden. Gram-negatieve bacteriën wijzigen ook de kern oligosaccharide structuur met variabele niet-stoichiometrische vervangingen van suikers, of extra kdo moleculen, en veranderen het aantal acylketens op lipide-A disaccharolipiden⁷.

De mogelijkheid om het IM te isoleren van de OM van gram-negatieve bacteriën is instrumenteel geweest voor het begrijpen van de rol van de celenvelop in antimicrobiële resistentie en ziektepathogenese^11,12. Afleidingen van deze aanpak zijn gebruikt om mechanismen van assemblage, onderhoud en remodelleren van het eiwit, fosfolipiden en glycolipid bestanddelen voor de OM af te leiden.

Ons lab voert routinematig bacteriële lipidomische analyses uit om eiwitgemedieerde lipideregulatie en lipidefunctie te bestuderen in een verscheidenheid van gramnegatieve soorten. De volumes die in het protocol worden gebruikt, weerspiegelen het routinematige gebruik van deze procedure om niet-radiolabelfolipiden te analyseren door dunne laagchromatografie en vloeibare chromatografie tandemmassaspectrometrie^13,14.

Het protocol begint met het blootstellen van een gekoelde suspensie van Gram-negatieve bacteriën aan een hoge osmolar oplossing van sacharose en het toevoegen van lysozyme om de OM te scheiden van de onderliggende peptidoglycan laag (Figuur 1)¹². EDTA wordt vervolgens toegevoegd om penetratie van de lysozyme te vergemakkelijken, omdat divalentkation kation equestration verstoort de laterale elektrostatische overbrugging interacties tussen aangrenzende LOS / LPS moleculen¹⁵. Het oorspronkelijke protocol waaruit de onze is aangepast vereiste de vorming van sferoplasten, een Gram-negatieve bacteriële celvorm die bestaat uit een plasmamembraan en cytosol, maar ontbreekt de peptidoglycan laag en een OM. Het is mogelijk dat sferoplasten worden geproduceerd volgens de aangepaste methode; echter, de techniek is niet afhankelijk of van plan op hun vorming voor succes. In plaats daarvan worden de met lysozyme-EDTA behandelde bacteriën snel geoogst door centrifugeren en opnieuw opgehangen in een sacharoseoplossing van mindere concentratie voordat ze onder druk staan. De OEM’s die kunnen zijn vrijgegeven door het vormen van sferoplasten moeten in theorie kunnen worden geoogst uit de supernatants van de behandelde cellen, maar deze aanpak is hierin niet gedetailleerd. Uiteindelijk worden de behandelde cellen onderworpen aan conventionele homogenisatie en lysis, wat de efficiëntie en reproduceerbaarheid van de membraanscheidingsprocedure^{verbetert 16}.

Na lysis worden de totale membranen verzameld door ultracentrifugatie en toegepast op een discontinu sacharosedichtheidgradiënt om de OEM’s en OEM’s te fractioneren. De klassieke benadering maakt gebruik van een meer continue gradiënt die bestaat uit ten minste vijf verschillende sacharose oplossingen^11,12. De discontinu gradiënt in ons protocol bestaat uit drie sacharoseoplossingen en verdeelt de tweelagen in twee verschillende breuken¹⁷. De LOS- en LPS-moleculen in de OEM’s van gramnegatieve bacteriën drijven de envelop naar een bovenste bruine IM-fractie met lage dichtheid en een lagere witte OM-fractie met hoge dichtheid(figuur 1 en figuur 2).

Acinetobacter baumannii zijn belangrijke multiresistente menselijke pathogenen die LOS moleculen produceren in hun OM en een celenvelop oprichten die moeilijk te scheiden is^18,19. Recent werk suggereert dat een afleiding van het protocol dat we hier presenteren kan worden gebruikt om de tweelagen van deze organismen te verdelen²⁰. Daarom hebben we ons protocol getest op A. baumannii 17978. Aanvankelijk was de procedure ontoereikend. We hebben echter de sacharoseconcentratie van de middendichtheidsoplossing gewijzigd en de scheiding aanzienlijk verbeterd(figuur 2). Een NADH dehydrogenase test en een LOS/LPS extractie- en detectieprocedure werden gebruikt om de scheiding voor A. baumannii, wild-type S te bevestigen. Typhimurium en twee O-antigeentekorten van enterobacteriële genotypen; namelijk galE-mutant S. Typhimurium en een laboratoriumstam, E. coli DH5α (figuur 3 en figuur 4).

De bedoeling van dit werk is om een gestroomlijnde aanpak te leveren voor het reproduceerend isoleren van de membranen van gramnegatieve bacteriën. Het protocol kan worden gebruikt om vele soorten membraan-geassocieerde moleculen voor deze microben te bestuderen.