Endokrin Bozan Bileşiklerin Östrojenik Etkilerini Test Etmek Için Tg(Vtg1:mcherry) Zebrabalığı Embriyolarının Kullanılması
Summary
Burada zebra balığı embriyoları Tg (vtg1: mCherry) östrojenik etkilerinin tespiti için kullanımı için ayrıntılı bir protokol dür. Protokol, balığın yayılmasını ve embriyoların tedavisini kapsar ve endokrin bozucu bileşiklerin (EDC) neden olduğu floresan sinyallerin saptanması, belgelenmesi ve değerlendirilmesini vurgular.
Abstract
Birçok endokrin bozan bileşikler vardır (EDC) ortamda, özellikle östrojenik maddeler. Bu maddelerin tespiti kimyasal çeşitliliği nedeniyle zordur; bu nedenle, östrojenik etkiye duyarlı biyomonitör/biyoindik organizmalar gibi giderek daha fazla etki algılayan yöntemler kullanılmaktadır. Bu biyomonitoring organizmalar çeşitli balık modelleri içerir. Bu protokol, edc tarafından indüklenen floresan sinyallerin tespiti, belgelenmesi ve değerlendirilmesi üzerinde durularak, balık ların yayılması ve embriyoların tedavisi de dahil olmak üzere, bir biyomonitoring organizma olarak zebra balığı Tg (vtg1: mCherry) transgenik hattın kullanımını kapsamaktadır. Çalışmanın amacı östrojenik etkileri tespit etmek için Tg (vtg1: mCherry) transgenik hat embriyolarının kullanımının gösteridir. Bu çalışma, iki östrojenik madde, α- ve β-zearalenol test ederek östrojenik etkilerin saptanması için transgenik zebra balığı embriyoları Tg (vtg1: mCherry) kullanımını belgeletir. Açıklanan protokol yalnızca tahlil ler tasarlamak için bir temeldir; test yöntemi, test uç noktalarına ve örneklere göre çeşitlendirilebilir. Ayrıca, diğer araştırma yöntemleri ile kombine edilebilir, bu nedenle transgenik hattın gelecekteki kullanımını kolaylaştırmak.
Introduction
Çevremizdeki en tehlikeli maddeler arasında yer alan önemli sayıda endokrin bozucu bileşik (EDC) bulunmaktadır. Bunlar esas olarak doğal kaynaklardan gelen suyu kirleten östrojenik bileşiklerdir. Gruba ait maddelerin kimyasal çeşitliliği, tespitleri için farklı analitik yöntemler gerektiğinden, varlıklarının test edilmesine neden olur. Kimyasal yapılarına göre bir maddenin aslında östrojen olarak hareket edip edemeyeceğini belirlemek çok zordur. Buna ek olarak, bu maddeler ortamda saf bir formda mevcut asla, bu yüzden etkileri diğer bileşikler, çok1etkilenebilir. Bu sorun, östrojenik etkiler gösteren biyomonitör/biyoindik organizmaların kullanımı gibi etki algılama yöntemleri ile çözülebilir2,3,4,5.
Son zamanlarda, hücre hattıçeşitli 6 ve maya tabanlı test sistemleri2,3 östrojenik etkileri tespit etmek için geliştirilmiştir. Ancak, bu genellikle sadece östrojen reseptörüne maddenin bağlanmasını tespit edebiliyoruz2,3. Buna ek olarak, organizmadaki karmaşık fizyolojik süreçleri modelleyemiyorlar veya yaşam evrelerinin hormona duyarlı evrelerini tespit edemiyorlar; bu nedenle, genellikle yanlış sonuçlara yol açar.
Bazı genlerin canlı organizmalarda östrojene duyarlı tepki verdiği bilinmektedir7. Gen ürünlerinin moleküler biyoloji yöntemleri ile saptanması protein veya mRNA düzeyi8,9’dada mümkündür, ancak genellikle hayvan kurban edilmeyi içerir. Hayvan koruma yasaları sıkı hale gelmiştir ve deneylerde kullanılan hayvanların sayısını ve acılarını en aza indiren veya hayvan modelinin başka bir model sistemi10ile değiştirilmesini en aza indiren alternatif test sistemleri için artan bir talep vardır. Floresan proteinlerin keşfi ve biyomarker hatlarının oluşturulması ile, transgenik teknolojiler iyi bir alternatif11sağlar. Bu çizgilerle, östrojene duyarlı bir genin aktivasyonu in vivo test edilebilir.
Omurgalılar arasında, çevresel risk değerlendirmesinde balık potansiyeli göze çarpar. Memeli modellerine göre pek çok avantaj sunarlar: sucul organizmalar oldukları için, tüm vücutlarındaki kirleticileri absorbe edebiliyoruz, çok sayıda yavru üretebiliyorlar ve bazı türlerinin kısa nesil süresi ile karakterize ediliyor. Onların endokrin sistem ve fizyolojik süreçleri diğer omurgalılar ve hatta memeliler ile büyük benzerlikler göstermek, insanlar da dahil olmak üzere12.
Balıklarda östrojenik etkilerin saptanması için çeşitli genler de bilinmektedir. En önemli östrojen reseptörleri aromataz-b, koryojenin-H, ve vitellogenin (vtg)7,13. Son zamanlarda, birkaç östrojen üreten biyosensör hatları da zebra balığı gibi laboratuvarda kullanılan balık modelleri oluşturuldu (Danio rerio)4,5,14,15,16,17. Biyosensör hatları oluştururken zebra balığının en büyük avantajı embriyove larvaların saydam gövdesidir, çünkü floresan muhabir sinyali hayvandan ödün vermeden in vivo’da kolayca incelenebilir10. Hayvan koruma ek olarak, aynı zamanda tedavinin farklı zamanlarda aynı bireyin reaksiyonu incelenmesi için izin verir gibi değerli bir özelliktir18.
Bu deneyler bir vitellogenin muhabiri transgenik zebra balığı hattı15kullanın. Tg(vtg1:mCherry) gelişimi için kullanılan transgen yapı uzun (3.4 kbp) doğal vitellojenin-1 organizatörü vardır. Östrojen reseptörü (ER) steroid / nükleer reseptör superfamily bir temsilcisi olan ligands tarafından aktive bir arttırıcı proteindir. ER yüksek yakınlık ile östrojen yanıt elemanları (EREs) olarak adlandırılan belirli DNA dizileri bağlanır ve estradiol ve diğer östrojenik maddelere yanıt olarak gen ekspresyonu transaktive, bu yüzden organizatör daha fazla ERE daha güçlü bir yanıt neden olur19. Tg(vtg1:mCherry) transgen yapısının promotör bölgesinde 17 ERE sitesi vardır ve yerli vtg geninin ekspresyonunu taklit etmeleri beklenmektedir15. Cinsel olarak olgunlaşmış kadınlarda floresan sinyalin sürekli bir ifadesi vardır. Ancak, erkeklerde ve embriyoda karaciğerdeki ifade sadece östrojenik maddelerle tedavi ile görülebilir(Şekil 1).
Şekil 1: Vtg1:mCherry transgenik erişkin zebra balığı ve 5 dpf embriyonun karaciğerinde 17-ß-estradiol (E2) indüksiyonu takiben kırmızı floresan sinyal. E2 ile tedavi edilen kadın ve erkekte (25 μg/L maruz kalma süresi:48hrs) karaciğerin güçlü floresansı pigmentli deride bile görülebilir. İşlenmemiş erkekte floresan sinyal görülmez (A). E2 indüksiyonu (50 μg/L maruz kalma süresi: 0-120 hpf) sonrasında, kontrol embriyolarında görünmeyen 5 dpf embriyonun karaciğerinde kırmızı floresan sinyal de görülebilir (B). Floresan sinyal yetişkin kadınlarda sürekli mevcut iken, öncelikle erkek ve çizginin embriyolar östrojenik etkileri tespit etmek için uygundur. (BF: parlak alan, mCherry: kırmızı floresan filtre görünümü, tek düz görüntüler, Ölçek çubuğu A: 5mm, ölçek çubuğu B: 250 μm) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Endojen vitellojenin benzer, mCherry muhabiri sadece karaciğer ifade edilir. Vitellojenin sadece östrojen varlığında üretilen çünkü, kontrollerde hiçbir floresan sinyal yoktur. İfade sadece karaciğerde olduğundan, sonuçların değerlendirilmesi çok daha kolaydır15.
Bu hattın embriyolarının duyarlılığı ve kullanılabilirliği çeşitli östrojenik bileşik karışımlar üzerinde ve ayrıca çevresel örneklerde15,20, araştırılmış ve çoğu durumda doz-yanıt ilişkileri belgelenmiştir(Şekil 2). Ancak, son derece toksik durumunda, özellikle hepatotoksik, maddeler (örneğin, zearalenone), sadece çok zayıf floresan sinyal tedavi embriyoların karaciğer görülebilir ve neden maksimum yoğunluklu floresan sinyal çok küçük bir konsantrasyon aralığı içinde ulaşılabilir, hangi zor doz-etkisi ilişkileri kurmak için yapar20.
Şekil 2: Karaciğerin (B) 17-α-ethynilestradiol (EE2) maruz kalan doz-yanıt diyagramı (A) ve floresan görüntüleri (MCherry), içinde 5 dpf vtg1:mCherry larva. Sonuçlar, sinyal gücünden ve etkilenen alanın büyüklüğünden (±SEM, n = 60) oluşturulan entegre yoğunluk olarak ifade edilir. %100 gözlenen maksimum anlamına gelir. Floresan sinyal yoğunluğu konsantrasyonu ile kademeli olarak artmıştır. Ölçek çubuğu = 250 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Çevrede çeşitli östrojenik maddeler vardır, 17-β-estradiol (çevresel konsantrasyon: 0.1-5.1 ng/L)21, 17-α-ethynylestradiol (çevresel konsantrasyon: 0.16-0.2 μg/L)22, zearalenone (çevresel konsantrasyon: 0.095-0.22 μg/L)23, bisfenol-A (çevresel konsantrasyon: 0.45-17.2 mg/L)24. Bu maddeleri mCherry transgenik embriyolar yardımıyla saf aktif bir formda test ederken, floresan işaret tespiti için en düşük gözlenen etki konsantrasyonları (LOEC) 17-ß-estradiol için 100 ng/L, 17-α-ethynilestradiol için 1 ng/L, zearalenone için 100 ng/L ve bisfenol-A (96-120 hpf tedavi) için 1 mg/Lidi. Tg(vtg1:mCherry) transgenik hattı doğrudan maruz kaldıktan sonra atık su örneklerinde östrojeniitenin saptandırılabiliyor. Çizgi olarak yaygın olarak kullanılan maya östrojen testi, bioluminiscent maya östrojen (BLYES) testi15kadar hassastır. Bu hattın yardımıyla, zearalenone kaynaklı toksisite karşı beta-siklodekstrinlerin koruyucu etkileri kimyasal karışımları kullanılarak teyit edilmiştir20.
Yakın tarihli bir raporda transgenik hattın in vivo kullanımı iki östrojenik zearalenon (ZEA) metaboliti, α- ve β-zearalenol (α-ZOL ve β-ZOL)25. Protokol taban çizgisi, çeşitli bileşiklerin veya çevresel örneklerin Tg(vtg1:mCherry) embriyoları üzerindeki östrojenik etkilerini incelemek için uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toksikolojik çalışmalarda östrojenik etkiler için biyomonitör/biyogöstergelerin kullanımı yaygınlaştırılmıştır. In vivo modeller olağanüstü bir rol oynar, çünkü vitro testlerin aksine, onlar sadece bir hücre veya reseptör tepkisi hakkında bilgi sağlamak değil, aynı zamanda organizmada karmaşık süreçlerin araştırılmasına izin. Östrojenik etkileri incelemek için çeşitli transgenik çizgiler zebra balığından üretilmiştir, bunlardan biri bu çalışmalar için Tg (vtg1:mCherry…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Araştırma, Geliştirme ve İnovasyon Ofisi (NKFIH) tarafından Ulusal Araştırma, Geliştirme ve Yenilik Fonu’ndan (NKFIA) desteklenmiştir; Hibe Sözleşmesi: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 avrupa birliği tarafından ortaklaşa finanse edilen proje ve Yenilik ve Teknoloji Bakanlığı tarafından verilen Szent István Üniversitesi’nin NKFIH-831-10/2019 Tematik Mükemmellik Programı.
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
References
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).
- Sanseverino, J., et al. Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).
- Fetter, E., et al. Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish. Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).
- Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species. Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).
- Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen – a microarray approach. BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).
- Vander Ven, L. T. M., et al. Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation. Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).
- Bakos, K., et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments – A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Tsang, M. Zebrafish : A Tool for Chemical Screens. Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).
- Chen, H., et al. Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens. Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).
- Bakos, K., et al. Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples. Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).
- Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system. Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).
- Tong, S. K., et al. A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).
- Segner, H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Faisal, Z., et al. Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos. Chemosphere. 240, 1-11 (2020).
- Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).
- Kuch, H. M., Ballschmiter, K. Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range. Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).
- Lundgren, M. S., Novak, P. J. Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).
- Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).
- Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins’ 1 EFSA. EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species – an update. Altex. 22 (50), 87-102 (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish. Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).
- Tao, T., Peng, J. Liver development in zebrafish (Danio rerio). Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).
- Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins. Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).
- Panel, E., Chain, F. Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 14, 4425 (2016).
- Binder, E. M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).
- Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains. Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).
