Trasformazione della radice di pomodoro seguita da inoculazione con Ralstonia Solanacearum per un'analisi genetica diretta della malattia batterica di Wilt

Ralstonia solanacearum, l’agente causale della malattia dell’avvistamento batterico, è un devastante patogeno vascolare del suolo con una distribuzione mondiale che può infettare una vasta gamma di specie vegetali, tra cui patate, pomodoro, tabacco, banana, pepe e melanzane, tra gli altri^1,2. Le perdite di rendimento causate da Ralstonia possono raggiungere l’80-90% della produzione di pomodoro, patate o banane, a seconda della cultivar, del clima, del suolo e di altri fattori³. Tuttavia, il modello Ralstonia è notevolmente poco esplorato rispetto ad altri modelli che coinvolgono patogeni vegetali batterici, come Pseudomonas siringae o Xanthomonas spp. Inoltre, la maggior parte degli studi sulle interazioni pianta-microbo si concentra sulla pianta modello Arabidopsis thaliana. Anche se la ricerca che utilizza questi modelli ha ampiamente contribuito alla nostra comprensione delle interazioni piante-batteri, non affrontano l’attuale necessità di comprendere queste interazioni nelle piante da coltura. La ricerca mirata a comprendere l’interazione tra Ralstonia e piante da coltura è essenziale per sviluppare soluzioni sostenibili per combattere le malattie dell’avvistamento batterico, ma è attualmente ostacolata dalla mancanza di semplici analisi sperimentali per caratterizzare i diversi componenti dell’interazione. In particolare, il pomodoro, un ospite naturale per Ralstonia, è la seconda coltura vegetale più importante al mondo ed è colpita da una pletora di malattie⁴, tra cui la malattia di avvizzimento batterico. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un metodo semplice per eseguire l’analisi genetica dell’infezione da Ralstonia del pomodoro. Questo metodo si basa sulla trasformazione mediata agrobacterium rhizogenesdelle radici di pomodoro, utilizzando la fluorescenza DsRed come marcatore di selezione⁵, seguita dall’inoculazione del suolo di Ralstonia delle piante risultanti, contenente radici trasformate che esprimono il costrutto di interesse. La versatilità dell’analisi della trasformazione della radice consente di eseguire la sovraespressione genica o il silenziamento genico mediato dall’RNAi.

Una potenziale limitazione di questo metodo consiste nella crescita residua di radici non trasformate. Ciò è particolarmente importante nei casi in cui il plasmico usato manca di un gene reporter che consenta la selezione delle radici trasformate. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un metodo alternativo basato sulla selezione degli antibiotici, che inibisce la crescita di radici non trasformate, consentendo la crescita di radici trasformate sane resistenti agli antibiotici. Poiché A. i rizogeni non inducono la trasformazione dei germogli, sono suscettibili all’antibiotico e, pertanto, dovrebbero essere tenuti separati dal mezzo contenente antibiotici.

Anche se la resistenza alle piante contro Ralstonia non è ben compresa, diversi rapporti hanno associato alterazioni della parete cellulare a una maggiore resistenza all’appassimento batterico^6,7,8^,9.⁹ È stato suggerito che queste alterazioni della parete cellulare influenzano lo sviluppo vascolare, un aspetto essenziale per lo stile di vita di Ralstonia all’interno della pianta¹⁰. Le mutazioni nei geni che codificano la cellulosa sintetizzano CESA4, CESA7 e CESA8 in Arabidopsis thaliana hanno dimostrato di compromettere l’integrità della parete cellulare secondaria, causando una maggiore resistenza a Ralstonia, che sembra essere collegato alla segnalazione ABA⁸. Therefore, as a proof of concept for our method, we performed RNAi-mediated gene silencing of SlCESA6 (Solyc02g072240), a secondary cell-wall cellulose synthase, and ortholog of AtCESA8 (At4g18780). La successiva inoculazione del suolo con Ralstonia ha mostrato che il silenziamento di SlCESA6 ha migliorato la resistenza di SlCESA6 ai sintomi dell’avvizzimento batterico, suggerendo che la resistenza mediata dalla parete cellulare a Ralstonia è probabilmente conservata nel pomodoro e convalidando il nostro metodo per effettuare analisi genetiche della resistenza batterica delle wilt nelle radici del pomodoro. Qui, descriviamo questo metodo in dettaglio, consentendo agli approcci genetici di comprendere la malattia dell’avvizzimento batterico in un tempo relativamente breve e con piccoli requisiti di attrezzature e spazio di crescita delle piante.