Indicadores de sinapsis únicas de liberación y aceptación de glutamato en rebanadas cerebrales agudas de ratones normales y Huntington
Summary
Presentamos un protocolo para evaluar el equilibrio entre la liberación de glutamato y el aclaramiento en sinapsis glutamatérgicas corticostriatales en rodajas agudas de ratones adultos. Este protocolo utiliza el sensor fluorescente iGluu para la detección de glutamato, una cámara sCMOS para la adquisición de señal y un dispositivo para la iluminación láser focal.
Abstract
Las sinapsis son unidades funcionales altamente compartimentadas que funcionan de forma independiente entre sí. En la enfermedad de Huntington (EH) y otros trastornos neurodegenerativos, esta independencia podría verse comprometida debido a la falta de aclaramiento de glutamato y los efectos resultantes de derrame y derrame. La cobertura astrocítica alterada de los terminales presinápticos y/o espinas dendríticas, así como un tamaño reducido de grupos transportadores de glutamato en los sitios de liberación de glutamato se han implicado en la patogénesis de enfermedades que resultan en síntomas de dis-/hipercinesia. Sin embargo, los mecanismos que conducen a la disfunción de las sinapsis glutamatérgicas en la EH no se entienden bien. Mejorando y aplicando imágenes de sinapsis hemos obtenido datos arrojando nueva luz sobre los mecanismos que impiden el inicio de movimientos. Aquí, describimos los elementos principales de un enfoque relativamente barato para lograr una resolución de sinapsis única mediante el uso del nuevo sensor de glutamato ultrarrápido codificado genéticamente iGluu, óptica de campo ancho, una cámara científica CMOS (sCMOS), un láser de 473 nm y un sistema de posicionamiento láser para evaluar el estado de las sinapsis corticostriatales en rodajas agudas de ratones sanos o enfermos apropiados para la edad. Los transitorios de glutamato se construyeron a partir de píxeles individuales o múltiples para obtener estimaciones de i) liberación de glutamato basada en la elevación máxima de la concentración de glutamato [Glu] junto a la zona activa y ii) la aceptación de glutamato como se refleja en la constante de tiempo de descomposición (TauD) del [Glu] perisyáptico. Las diferencias en el tamaño del bouton en reposo y los patrones contrastantes de la plasticidad a corto plazo sirvieron como criterios para la identificación de terminales corticostriatales como pertenecientes a la vía intratefel (IT) o al tracto piramidal (PT). Usando estos métodos, descubrimos que en ratones sintomáticos de la EH el 40% de las sinapsis corticostriatales de tipo PT presentaban un aclaramiento insuficiente del glutamato, lo que sugiere que estas sinapsis podrían estar en riesgo de sufrir daño excitotóxico. Los resultados subrayan la utilidad de TauD como biomarcador de sinapsis disfuncionales en ratones Huntington con un fenotipo hipocético.
Introduction
El impacto relativo de cada terminal sináptico perteneciente a una “conexión unitaria” (es decir, la conexión entre 2 células nerviosas) se evalúa típicamente por su influencia en el segmento inicial de la neurona postsináptica1,,2. Las grabaciones somáticas y/o dendríticas de las neuronas postsinápticas representan las más comunes y, hasta ahora, también los medios más productivos para aclarar el procesamiento de la información bajo una perspectiva descendente o vertical3,4,5. Sin embargo, la presencia de astrocitos con sus territorios discretos y (en roedores) no superpuestos puede contribuir a una perspectiva horizontal que se basa en mecanismos locales de intercambio de señales, integración y sincronización en sitios sinápticos6,,7,8,9,10.
Porque se sabe que la astroglia juega, en general, un papel importante en la patogénesis de la enfermedad neurodegenerativa11,12 y, en particular, un papel en el mantenimiento y la plasticidad de las sinapsis glutamatérgicas13,14,15,16, es concebible que las alteraciones en el rendimiento sináptico evolucionan de acuerdo con el estado de los astrocitos en el área de destino compartido de fibras aferentes con diversa sortividad. Para explorar más a fondo los mecanismos reguladores locales derivados de la astroglia en salud y enfermedad, es necesario evaluar las sinapsis individuales. El enfoque actual se elaboró para estimar el rango de indicadores funcionales de liberación y aclaramiento de glutamato y para definir los criterios que pueden utilizarse para identificar sinapsis disfuncionales (o recuperadas) en áreas cerebrales más estrechamente relacionadas con el inicio del movimiento (es decir, en primer lugar en la corteza motora y el estriado dorsal).
El estriado carece de neuronas glutamatérgicas intrínsecas. Por lo tanto, es relativamente fácil identificar aferentes glutamatérgicos de origen extratriatal. Estos últimos se originan principalmente en el tálamo medial y en la corteza cerebral (ver17,18,19,20 para más). Las sinapsis corticostriatales están formadas por los axónicos de las neuronas piramidales localizadas en las capas corticales 2/3 y 5. Los axones respectivos forman conexiones bilaterales intratelencéfalas (IT) o conexiones ipsilaterales a través de un sistema de fibra que constituye más caudalmente el tracto piramidal (PT). Además, se ha sugerido que los terminales de tipo IT y PT difieren en sus características de liberación y tamaño21,,22. En vista de estos datos, también se podrían esperar algunas diferencias en el manejo del glutamato.
El estriado es el área cerebral más afectada en la enfermedad de Huntington (EH)5. La EH humana es un trastorno neurodegenerativo hereditario genético grave. El modelo de ratón Q175 ofrece la oportunidad de investigar la base celular de la forma hipocinética-rígida de la EH, un estado que tiene mucho en común con el parkinsonismo. A partir de una edad de aproximadamente 1 año, los ratones homocigotos Q175 (HOM) presentan signos de hipocinesia, como se revela midiendo el tiempo pasado sin movimiento en un campo abierto23. Los actuales experimentos con ratones heterocigoto Q175 (HET) confirmaron los déficits motores anteriores observados en HOM y, además, mostraron que los déficits motores observados estaban acompañados por un nivel reducido de la proteína 2 del transportador de aminoácidos astrocíticos excitatorios (EAAT2) en las inmediaciones de los terminales sinápticos corticostria24. Por lo tanto, se ha planteado la hipótesis de que un déficit en la aceptación astrocítica de glutamato podría conducir a la disfunción o incluso la pérdida de las respectivas sinapsis25,26.
Aquí, describimos un nuevo enfoque que permite evaluar el aclaramiento de glutamato de sinapsis única en relación con la cantidad del neurotransmisor liberado. El nuevo sensor de glutamato iGluu se expresó en neuronas piramidales corticostriatales. Fue desarrollado por Katalin T’r-k27 y representa una modificación del sensor de glutamato de alta afinidad pero lento iGluSnFR28introducido anteriormente. Ambos sensores son derivados de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP). Para las características espectrales y cinéticas, véase Helassa et al.27. En resumen, iGluu es un sensor de baja afinidad con cinética de desactivación rápida y por lo tanto particularmente adecuado para estudiar el aclaramiento de glutamato en terminales sinápticos que liberan glutamato. La constante de tiempo de disociación de iGluu se determinó en un dispositivo de flujo detenido, que hacía un valor de Tauapagado de 2,1 ms a 20 oC, pero 0,68 ms cuando se extrapolaba a una temperatura de 34 oC27. Los terminales colaterales Single Schaffer sondeados a 34 oC con escaneo láser en espiral en la región CA1 de cultivos de hipocampo organotípicos bajo un microscopio de 2 fotóns exhibieron una constante de tiempo medio de descomposición de 2,7 ms.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los experimentos se refieren a una cuestión de interés general: la independencia de la sinapsis y su posible pérdida en el curso de la neurodegeneración, y describimos un nuevo enfoque para identificar las sinapsis afectadas en rebanadas cerebrales agudas de ratones envejecidos (>1 año). Aprovechando las características cinéticas mejoradas del sensor de glutamato recientemente introducido iGluu los experimentos iluminan la relación entre la liberación y la absorción del glutamato sináptico de una ma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por CHDI (A-12467), la Fundación Alemana de Investigación (Exc 257/1 y DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) y los Fondos de Investigación Intramuros de la Charité. Agradecemos a K. Társk, St. George’s, Universidad de Londres, y N. Helassa, Universidad de Liverpool, por el plásmido iGluu y muchas discusiones útiles. D. Betances y A. Sch-nherr proporcionaron una excelente asistencia técnica.
Materials
| Stereo microsope | WPI | PZMIII | Precision Stereo Zoom Binocular Microscope |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | Digital Lab New Standard stereotaxic frame |
| High speed drill equipment | Stoelting | 514439V | Foredom K1070 cromoter Kit |
| Injection system | Stoelting | 53311 | Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) |
| Hamilton syringe 5 µl | Hamilton | 87930 | 75RN Syr (26s/51/2) |
| Laser positioning system | Rapp OptoElectronic | UGA-40 | UGA-40 |
| Blue laser for iGluu excitation | Rapp OptoElectronic | DL-473-020-S | 473 nm laser |
| Dichroic mirror for 473 nm | Rapp OptoElectronic | ROE TB-355-405-473 | Dichroic |
| 1P upright microscope | Carl Zeiss | 000000-1066-600 | Axioskop 2 FS Plus |
| Objective 63x/1.0 | Carl Zeiss | 421480-9900 | W Plan-Apochromat |
| 4x objective | Carl Zeiss | 44-00-20 | Achroplan 4x/0,10 |
| Dichroic mirror for iGluu | Omega optical | XF2030 | |
| Emission filter for iGluu | Omega optical | XF3086 | |
| Dichroic mirror | Omega optical | QMAX_DI580LP | |
| Emission filter for autofluorescence subtr. | Omega optical | QMAX EM600-650 | |
| sCMOS camera | Andor | ZYLA4.2PCL10 | ZYLA 4.2MP Plus |
| Acqusition software | Andor | 4.30.30034.0 | Solis |
| AD/DA converter | HEKA Elektronik | 895035 | InstruTECH LIH8+8 |
| Aquisition software | HEKA Elektronik | 895153 | TIDA5.25 |
| Electrode positioning system | Sutter Instrument | MPC-200 | Micromanipulator |
| Electrical stimulator | Charite workshops | STIM-26 | |
| Slicer | Leica | VT1200 S | Vibrotome |
| Brown/Flaming-type puller | Sutter Instr | SU-P1000 | P-1000 |
| Glass tubes for injection pipettes | WPI | 1B100F3 | |
| Glass tubes forstimulation pipettes | WPI | R100-F3 | |
| Tetrodotoxin | Abcam | ab120054 | TTX |
| iGluu plasmid | Addgene | 106122 | pCI-syn-iGluu |
| Q175 mice | Jackson Lab | 27410 | Z-Q175-KI |
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