Summary

쌀의 경작 인구에서 고분해능 용융에 의한 돌연변이 식별

Published: September 02, 2019
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Summary

이 문서에서는, 우리는 고분해능 용융 분석 (HRM) 기지를 둔 표적 유도한 게놈에 있는 국소 병변으로 기술되는 프로토콜을 제시합니다 (TILLING). 이 방법은 DNA 이중의 용융 동안 형광 변화를 이용하고 삽입 / 삭제 (Indel) 및 단일 염기 서브 스티션 (SBS)의 높은 처리량 스크리닝에 적합합니다.

Abstract

게놈에서 표적 유도국부 병변 (TILLING)은 유도된 돌연변이의 높은 처리량 스크리닝을 위한 역유전학의 전략이다. 그러나 TILLING 시스템은 삽입/삭제(Indel) 검출에 대한 적용가능성이 적으며, 전통적인 틸링은 CEL I 뉴클레아제 소화 및 겔 전기 영동과 같은 보다 복잡한 단계를 필요로 합니다. 처리량 및 선택 효율을 개선하고 인델 및 단일 베이스 대체(SBS)의 스크리닝을 가능하게 하기 위해 새로운 고해상도 용융(HRM) 기반 틸링 시스템이 개발되었습니다. 여기에서, 우리는 상세한 HRM-TILLING 프로토콜을 제시하고 돌연변이 검열에 있는 그것의 응용을 보여줍니다. 이 방법은 고온에서 이중 가닥 DNA의 변이를 측정하여 PCR 앰플리컨의 돌연변이를 분석할 수 있습니다. HRM 분석은 추가 처리 없이 PCR 후 직접 수행됩니다. 또한 간단하고 안전하며 빠른 (SSF) DNA 추출 방법은 HRM-TILLING과 통합되어 인델과 SBS를 모두 식별합니다. 단순성, 견고성 및 높은 처리량은 쌀 및 기타 작물의 돌연변이 스캐닝에 잠재적으로 유용합니다.

Introduction

돌연변이는 식물 기능 유전체학 연구 및 새로운 품종의 번식을위한 중요한 유전 자원이다. 전방 유전학 접근법(즉, 돌연변이 선택에서 유전자 복제 또는 다양한 발달에 이르기까지)은 약 20년 전에 유도된 돌연변이의 사용을 위한 주요 및 유일한 방법이었다. 새로운 역유전학 방법의 개발, TILLING (게놈에서 유도 된 국소 병변 을 표적으로) McCallum et al. 1은 새로운 패러다임을 열었고 이후 많은 수의 동물 및 식물 종2에적용되었습니다. TILLING은 기술적으로 어렵거나 비용이 많이 드는 특성(예: 질병 저항성, 미네랄 함량)을 사육하는 데 특히 유용합니다.

틸링은 처음에 화학적 돌연변이원(예를 들어, EMS1,3)에의해 유도된 스크리닝 포인트 돌연변이를 위해 개발되었다. 여기에는 다음 단계가 포함됩니다. DNA 준비 및 개별 식물의 풀링; 표적 DNA 단편의 PCR 증폭; CEL I 뉴클레아제에 의한 PCR 앰플리톤 및 절단의 변성 및 어닐링에 의한 이혈형성; 돌연변이 개인및 그들의 특정 분자 병변의 확인3,4. 그러나 이 방법은 여전히 비교적 복잡하고 시간이 오래 걸리며 처리량이 낮습니다. 더 효율적이고 높은 처리량으로, 삭제 틸링 (De-TILLING)(표1)1,3,5,6,등 많은 수정 된 틸링 방법이 개발되었습니다. 7,8,9,10,11,12.

DNA 이중의 용융 동안형광 변화에 기초한 HRM 곡선 분석은, 돌연변이 스크리닝 및 유전형 분석(13)을 위한 간단하고비용 효율적이며 높은 처리량 방법이다. HRM은 이미 EMS 돌연변이 유발 에 의해 유도된 SBS 돌연변이를 스크리닝하기 위한 HRM 기반 틸링(HRM-TILLING)을 포함하는 식물 연구에서 널리 사용되고 있다14. 여기에서, 우리는 쌀에 있는 감마 (γ) 광선에 의해 유도된 돌연변이 (인델 및 SBS 둘 다)의 검열을 위한 상세한 HRM-TILLING 프로토콜을 제시했습니다.

Protocol

1. 준비 γ선 돌연변이 인구의 발달 약 20,000개의 말린 쌀 씨앗을 치료하십시오(수분 함량은 14%) 100 Gy (1 Gy / min)에서 137Cs 감마선을 가진 자포니카 쌀 라인 (예를 들어, DS552)의 γ 조사 시설 (예를 들어, 감마 세포).참고: 치료에 사용되는 씨앗은 높은 생존율을 가져야합니다 (예 : 발아율 >85 %). 인디카 쌀에 대한 조사 용량은 150 Gy로 증가 될 수있다.</li…

Representative Results

HRM 스캐닝 및 분석 총 4,560M2 묘목에서 1,140개의 풀링된 DNA 샘플을 생산하고 PCR 증폭을 실시하였다. 195 bp 및 259 bp의 크기의 두 단편은 각각 OsLCT1 및 SPDT에대해 증폭되었다(표 2). 대부분의 시료는 WT(ΔF 0.05)와 현저히 다른 HRM 곡선은 소프트웨어에 의해 WT와 다른</s…

Discussion

TILLING은 유전자 기능 분석 및 작물 사육을 위한 유도된 돌연변이를 식별하기 위한 강력한 역유전 적 도구임이 입증되었습니다. 쉽게 관찰되거나 결정되지 않은 일부 특성의 경우, 고처리량 PCR 기반 돌연변이 검출을 이용한 틸링은 상이한 유전자에 대한 돌연변이를 얻는 유용한 방법이 될 수 있다. HRM-TILLING 방법은 돌연변이 스크리닝을 위해 토마토12,11 및 포?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (No. 2016YFD0102103)과 중국의 국립 자연 과학 재단 (No.31701394)에 의해 지원되었습니다.

Materials

2× Taq plus PCR Master Mix Tiangen, China KT201 PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plate Bio-rad, America MSP-9651 Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexus Eppendorf, German 6333000073 PCR amplification
LightScanner Idaho Technology, USA LCSN-ASY-0011 For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0 Idaho Technology, USA For analysis of the fluorescence change
EvaGreen Biotium, USA 31000-T Fluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000 Thermo Scientific, USA ND2000 For DNA quantification

References

  1. McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
  2. Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
  3. Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
  4. Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
  5. Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
  6. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
  7. Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
  8. Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
  9. Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
  10. Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
  11. Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
  12. Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
  13. Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
  14. Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
  15. Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , (1976).
  16. Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
  17. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
  18. Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
  19. Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
  20. Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
  21. Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
  22. Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).

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Cite This Article
Li, S., Yu, Y., Liu, S., Fu, H., Huang, J., Shu, Q., Tan, Y. Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice. J. Vis. Exp. (151), e59960, doi:10.3791/59960 (2019).

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