Этот протокол описывает оригинальную установку, сочетающую спектральные и флуоресцентные измерения продолжительности жизни для оценки реж. Фюрстерской рецензии на передачу энергии (ФРЭТ) между флуоресцентными зондами на основе родамина и лигнином-полимером непосредственно в толстых участках растений.
В лигноцеллюлозной биомассе (ЛБ) активность ферментов ограничена появлением неспецифических взаимодействий с лигнином в процессе гидролизного изокиса, который поддерживает ферменты вдали от их субстрата. Таким образом, характеристика этих сложных взаимодействий является сложной задачей в сложных субстратах, таких как LB. Метод здесь измеряет молекулярные взаимодействия между флюорофором помеченных молекул и родной аутофлуоресцентный лигнин, который будет выявлен Фюрстер резонансной передачи энергии (FRET). Вопреки измерениям ФРЕТ в живых клетках с использованием двух экзогенных флюорофоров, измерения ФРЕТ в растениях с использованием лигнина не являются тривиальными из-за его сложной аутофлуоресценции. Мы разработали оригинальный конвейер приобретения и анализа с коррелированным наблюдением двух взаимодополняющих свойств флуоресценции: флуоресценции и срока службы. sFLIM (спектральная и флуоресцентная микроскопия изображений в течение жизни) обеспечивает количественную оценку этих взаимодействий с высокой чувствительностью, выявляя различные уровни взаимодействия между биомолекулами и лигнином.
Гидролизуя лигноцеллюлоза в мономерные сахара, такие как глюкоза требует ферментов. Их деятельность, как известно, сдерживается созданием неспецифических взаимодействий между ферментами и лигнином1,2, последний является гидрофобным полимером и основным компонентом лигноцеллюлозы3. Таким образом, количественное измерение таких взаимодействий непосредственно в клеточном масштабе является проблемой, которая должна быть решена для оптимизации фермента каталитическая активность и lignocellulose предварительной обработки4.
Фюрстер (или флуоресценция) резонансная передача энергии (FRET) измерения является методом выбора осла биомолекул взаимодействия на месте. Эта не радиационная передача энергии может произойти между донором и принимающим фторфором, если они выполняют различные условия. Спектр донорских выбросов должен перекрывать, по крайней мере частично, спектр возбуждения. Таким образом, выбор фторофоров имеет решающее значение для таких экспериментов. Затем эффективность передачи снижается с шестой силой их расстояния5 и происходит только в том случае, если обе молекулы находятся в непосредственной близости (обычно в диапазоне нанометров). Другие непредвиденные обстоятельства могут изменить эффективность передачи, такие как дипольные наклонности, но смягчаются, если флюорофоры обладают гибкостью.
FRET можно измерить различными методами и подробные описания можно найти в литературе6,7. Короче говоря, основные методы опираются на: i) сенсибилизированные выбросы, при которых обеспечивается вариация флуоресценции допустимого эмиссии и обеспечивает в основном качественные результаты; ii) приемование фотоотбелечения, при котором флуоресценция донорских эмиссий измеряется до и после того, как принимает сятворщик фотоотбеление (в этом случае более точные оценки ФРЕТ могут быть получены, но требуют сильной лазерной энергии, применяемой к фиксированным образцам); и iii) измерение продолжительности жизни, которое уменьшается для донора в присутствии принимающего. Этот метод требует конкретных инструментов и позволяет точные и чувствительные измерения взаимодействия между фторфорами. Учитывая измерения FRET между флуоресцентными зондами и лигноцеллюлоза, основная трудность заключается в том, что lignocellulose не является одним хорошо характеризуется флюророфор: он имеет сильный родной и спектрально-широкий автофлуоресценции, в основном происходящих из лигнина, и зависит от вида биомассы8,9.
В настоящем документе мы предлагаем новую и оригинальную процедуру, адаптированную к участкам образцов древесины/растений. Этот метод на основе sFLIM открывает путь к количественным измерениям ФРЕТ между флуоресцентными зондами и лигнином в образцах лигноцеллюлозы.
Коррелирование измерений флуоресценции и спектра выбросов позволяет сочетать преимущества обоих методов. Действительно, спектральные измерения сами по себе не имеют чувствительности и остаются качественными. С другой стороны, срок службы флуоресценции является методом выбора для традиционных количественных измерений FRET, но было продемонстрировано, что лигнин аутфлуоресценции может варьироваться в зависимости от состава лигнина и окружающей среды16. Таким образом, взаимодействия лигнина с принимающим или лигнином структурных изменений не могут быть дискриминированы, поскольку они оба приводят к пожизненному снижению. Как показано, разработанный метод обеспечивает недвусмысленное, чувствительное и количественное измерение взаимодействий между молекулами лигнина и принимая в растительных секциях. Даже если различные этапы метода были тщательно оптимизированы, следует проявлять осторожность в следующих моментах.
Что касается образцов, то качество секции растений имеет решающее значение для обеспечения вфокусайсъемки. Следует строго соблюдать различные шаги для встраивания ПЭГ. Окончательный шаг стирки имеет важное значение для обеспечения не вмешательства от ПЭГ, оставшихся в образцах. Кроме того, концентрация буфера и рН должны быть строго идентичны для всех измерений, так как любое изменение может оказать сильное влияние на свойства флуоресценции.
Измерение продолжительности жизни также может быть деликатным. Флуоресценция жизни донора может быть нестабильной, например, из-за высокого возбуждения. В таком случае, настройка лазерной мощности и зум может исправить эту проблему. Другим известным источником артефактов в измерениях TCSPC является накопление фотона пульса. Действительно, TCSPC не может измерить скорость двух фотонов, испускаемых между теми же двумя лазерными импульсами. В то время как образцы растений очень структурированы, флуоресценция не однородна и может привести к скрытому эффекту свайного импульса. В то время как количество фотонов в секунду остается ниже 1% предела возбуждения, оно может быть выше в некоторых областях выборки. Для того чтобы не быть экспериментами pileup, измерять продолжительность жизни флуоресценции дарителя на по-разному потоке фотона можно рассматривать. Если продолжительность жизни увеличивается, в то время как поток уменьшается, эффект скопирования изменяет измерения. Оптимальный поток фотона достигается при стабильности жизни донора.
Что касается анализа кривой распада sFLIM, мы рекомендуем полагаться на каждую индивидуальную кривую, чтобы убедиться, что модель точно описывает измерения. Если это не так, сначала убедитесь, что ни один из ранее упомянутых артефактов не повредил данные. Затем, шаг 2.1.4 обеспечивает инструментальную функцию реагирования (IRF) системы. Если IRF представляет некоторые аномалии, оптимизировать оптический путь, чтобы свести их к минимуму. Также можно использовать измеренный IRF для установки во время этапа 6.2. Наконец, степень свободы подходящей модели может быть увеличена до трехэкспоненциального распада в шаге 6.2. Тем не менее, количество фотонов, необходимых для индивидуальной жизни и пропорции определения высока, и поэтому рекомендуется только использовать их для достижения более стабильной средней жизни от шага 6.4. Более исчерпывающая информация о FLIM, его характеристика18, sFLIM и его применение12 в частности лигнин10, можно найти в литературе.
Хотя это и сложно, измерения FRET в тканях растений с использованием родной автофлуоресценции показывает некоторые преимущества. По сравнению с измерениями FRET, проведенными на живых тканях, в которых исследования взаимодействия между биомолекулами часто требуют генной инженерии, чтобы выразить внутренние флуоресцентные маркеры, лигнифицированные ткани растений, как те, которые представлены здесь, предлагают естественные автофлюоресценции, и натримы партнера флуоресцентные зонды могут быть легко добавлены, экономя много времени. Однако, в зависимости от проанализированных видов растений и от возможных предварительных процедур, аутофлуоресценции, вероятно, будет изменен, так что она должна быть тщательно охарактеризована и фторофора, используемого в качестве зондов, возможно, потребуется адаптировать.
Метод sFLIM должен применяться к флуоресцентным зондам, не имеющим каталитической активности (PEG и dextran). В рамках гидролизового лигноцеллюлозы растений могут быть выполнены взаимодействия ферментов в различных образцах биомассы, что, возможно, приведет к определению влияния локализации (клеток и тканей) на силу взаимодействия. Следующим шагом оптимизации станет автоматизация шага анализа. Действительно, при достаточном количестве проанализированных данных можно было бы развернуть процедуру анализа на основе машинного обучения для автоматизированного анализа фенотипа, что повысило бы его удобство для быстрого скрининга эффективности фермента биомассы. Кроме того, sFLIM не требует фиксации образца и может быть легко применен к динамическим исследованиям взаимодействия фермента-лигнина. Такой уникальный метод, вероятно, будет направлять стратегию ферментостроения и предобработку биомассы для оптимизации валоордизации лигноцеллюлозы.
The authors have nothing to disclose.
Фанни Лоран (FARE) тепло поблагодарила за подготовку фигур. Федерация исследований FRABio (Лилльский университет, CNRS) признана за обеспечение технической среды, способствующей достижению этой работы. Финансирование было получено от Национального исследовательского агентства Франции (проект LIGNOPROG ANR-14-CE05-0026).
Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
fine brush | to collect sections | ||
glass vials | for incubations | ||
high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
nail polish | for mounting | ||
pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |