オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養

眼モーターシステムは軸の指導メカニズムを調査するための優雅なシステムを提供する。眼を動かす6つの眼外筋肉(EOEM)を抑える3つの頭蓋神経と、まぶたを持ち上げるレベーター・パルペブラー・エクセピアス(LPS)からなる、比較的単純である。オキュロモーター神経は、LPSと4つのEOEMを刺激する – 劣った斜めと中間、劣った、および優れた直腸筋。他の2つの神経は、トロクレアとアブデューセン、それぞれ1つの筋肉、優れた斜めおよび横直腸筋をそれぞれインビナートする。目の動きは、内向きが適切であるか、欠落しているか、または異常であるかどうかを示す、容易な読み出しを提供します。さらに、神経発達または軸次指導の欠損に起因するヒト眼球運動障害があり、総称して先天性頭蓋骨減少障害(CCDDs)1と呼ぶ。

これらの利点にもかかわらず、眼モーターシステムは、アクソンガイダンス研究2、3、4、5、6、7、8^でほとんど使用されない^9,10、技術的な欠点のため。インビトロ軸ゴンガイダンスアッセイは、多くの欠点^{を有する 11}.共培養アッセイは、ニューロン移植が標的^組織12またはトランスフェクト^細胞13の移植と共に培養されるもので、移植の対称性と移植組織と標的組織との間の正確な位置決めの両方に依存する。ストライプアッセイ14、15、交互のストライプに2つのキューが置かれ、軸が1つのストライプ上で優遇成長のために評価されるが、一方の基板が他方よりも好ましいことを示すだけで、どちらかが魅力的であるわけではないまたは反発的、または生理学的に関連する。マイクロ流体室は、正確な化学勾配を形成することができますが、被験者は、その成長に影響を与えることができる応力16、17、18をせん断する軸を成長させる。さらに、これらのアプローチのそれぞれにおいて、移植または解離細胞を採取するには、生育軸子が軸化され、したがって、これらのアッセイは、初期軸子の増殖ではなく、実際に軸の再生を調べる必要があります。最後に、これらのインビトロアプローチは、軸が軸に影響を与える微小環境を除去し、そのコースの異なるポイントに沿って手がかりに対する応答を除去し、従来は1つのキューを単独でテストするだけです。これらの欠点を複合化すると、眼モータシステム内の各核のサイズが小さいため、移植または解離培養物の解剖は技術的に困難になります。さらに、眼運動ニューロンの一次培養は、通常、不均一であり、有意な細胞死を有し、密度依存性であり、複数の胚からの細胞のプールを必要とする(藤木良樹、個人的なコミュニケーション)。しかし、ノックアウトマウスモデルを含む生体内法では、必要な時間と費用を考えると、スクリーニングに使用することは不適切です。

胚全体を培養するために開発された方法¹⁹は、移動細胞²⁰または特定の分子の遮断の標識を可能にするが、胚培養全体は、標識のリアルタイムイメージングを妨げるローラーボトル内のインキュベーションを必要とする構造。胚の操作を可能にし、その後、子宮または母親の腹部のいずれかのさらなる発達を可能にする外科的技術(胎盤接続を維持する)22も可能であるが、これらはまた、時間経過を可能にしないイメージング。

インビトロアッセイの障害を克服し、シグナル伝達経路の迅速なスクリーニングを可能にするために、exvivo胚スライス培養技術が23を開発し、末梢神経の成長24に関する以前に公表されたプロトコルから適応した。このプロトコルを使用して、発達するオキュロモーター神経は、EOMターゲットを含む軌道に沿った周囲の構造の多くが存在する場合に、時間の経過とともに画像化することができる。培養培地に低分子阻害剤、成長因子、またはガイダンス手がかりを加えることで、軸ゾン軌道に沿った複数の点でガイダンス摂動を評価し、潜在的な成長因子とガイダンス因子をより迅速に評価することができます。