行動実験に用いたジャンプクモのカラーパターンの操作

1. 機器の準備 適切な塗料を選択。 アプリケーションを成功させるには、速乾性のある塗料を使用し、薄い質感でも簡単に操作できるようにします。使用されている製品には、水で薄くすることができる非防水アイライナー、エナメルシンナーで薄くすることができるエナメル塗料 (材料のテーブル) が含まれます。 クモを塗るとき、ほとんどの種の甲羅は、柔らかい腹部がしばしば伸びて、40を供給すると収縮しながら、硬化した外骨格を有することを考慮してください。 エナメル塗料は、塗装面にしっかりと硬化したコーティングを生成します。したがって、キューティクルの硬い部分 (例えば、甲羅、脚、pedipalps) にそれらを適用します。このようなエナメルコーティングは、腹部が餌で形を変えるのでクモの皮をむくので、クモの abdomens にはあまり効果がありません。 対照的に、アイライナーは硬化したコーティングを生成せず、むしろ着色されたボディスケールに浸透する。そのため、ハードとソフトの両方のボディパーツ (スパイダー abdomens を含む) で使用します。注: 次のステップでは、クモの顔と pedipalps を塗ることから成る最も繊細なテクニックが提示されます。エナメル塗料が使用されており、エナメル塗料の色の多様性により最も汎用性方法です。 可能であれば、生きている動物に塗料をテストする前に、最初のスペクトルに不要な UV ピークがないことを確認するために、UV-VIS 反射率分光光度計を使用して、塗料のスペクトル特性 (単に紙または別の表面に適用) を測定する人間には見えませんが、研究された種に見える可能性があります。 より容易にドキュメンテーションのための操作および増加の再現性 (材料のテーブル) の結果の写真を取るためにカメラおよびコンピュータに接続される解剖顕微鏡を使用しなさい。 カメラ入力を処理する顕微鏡、コンピュータ、およびソフトウェアをオンにします。 最終的な画像が撮影される、関連するズームを選択します。 昆虫の取り付けピンまたは小さな釘 (頭を外側に向ける) を、非硬化モデリング粘土 (約ブドウの大きさ) のボールに刺します。(ペイントされるライブスパイダーは、以下のステップ3.1 でこのピンのヘッドに一時的に取り付けられます)。モデリング粘土とピンを顕微鏡の下に置き、ピンの頭 (クモが取り付けられる場所) におおよそ焦点を合わせるように目的を調整します。 目的が画家の目にとって正しい距離にあること、およびカメラが塗装中に視界を妨げていないことを確認してください (カメラが oculars の1つに取り付けられ、奥行き知覚を妨げる場合など)。 きれいなプラスチックスナップキャップバイアルにクモを転送します (約 12 dram, 任意のウェビングや死んだ獲物なしで). 取り付けと塗装装置を準備します。 余分な薄い虫の取り付けピンを、(ステップ1.2.3 で使用されている) 非硬化モデリング粘土のボールに置き、顕微鏡の左側に (右利きの人のために) 置きます。このピンは、塗装中にスパイダーの脚と pedipalps の位置を調整するために使用されます (必要に応じて)。 (ペーパータオルなど) の吸収性の紙の小片、白いプリンタ紙、適用する塗料 (ここでは、エナメル塗料) を取得し、シンナーの別の容器 (各色に加えて透明で清潔なものに1つずつ)、各色のための個々のマイクロブラシ(材料の表を参照してください)、および1マイクロブラシはきれいなシンナーでのみ使用され、すべては顕微鏡の右 (右利きの人のために) で組織的な方法で配置されています。 爪楊枝を使用して、開いたプラスチック皿 (小さなペトリ皿やバイアルキャップなど) にペンキの滴を加え、小さな注射器などで塗料を薄くします。マイクロブラシで白いプリンタ紙にそれをテストすることにより、右の一貫性に爪楊枝で2を混ぜます (塗料が完全に均質化し、あまりにも鼻水はありません)。注: 特定のケースでは、塗料がすぐに乾く場合は、アプリケーションに必要なより少し液体でそれを準備し、ブラシが後で使用するまでシンナーの鍋に浸してみましょう (ステップ 4)。 水ベースの接着剤 (材料の表を参照) のエンドウ豆サイズのドロップを、プリンタ用紙の角に置きます。注: これは準備の最後の段階でなければならず、次のステップは、接着剤が乾燥しないように、この後すぐに起こる必要があります。 2. クモの麻酔 バイアル内のクモとひらがを防ぐために、開口部の上に手を通して、ゆっくりと、クモの第3の足が180度まで伸びるまで co2 ガスを加える。 種の平均サイズと個々のクモに応じて、約20秒から1.5 分までの CO2への暴露時間を使用します。我々は、 pyrrithrixにおける麻酔の適切なレベルの信頼できる指標となるように、第3の足のペアの延長を発見したが、これは種によって異なる可能性がある。これらの技術を初めて異なる種で使用する場合は、最初にいくつかの標本で麻酔をテストし、その応答を評価します。 必要なレベルの麻酔を達成するために、できるだけ少ない CO2を与えてください。ここで説明した麻酔の短い期間は、死亡率を産生しませんでした (そして、非麻酔されたクモからの顕著な行動の違いはありません), 実験ですべての動物に同じレベルの麻酔を与えます (シャムコントロールを含む). クモを麻酔下に維持するために CO2を加えた後に、バイアルを閉じたままにします。したがって、スパイダーがどのくらいの期間、CO2にさらされるかを計算するときに、この時間が含まれます。 スパイダーは、色の操作を開始するためにバイアルから除去された後、約1〜2分間完全に麻酔をかけたままになります。したがって、次の手順 (セクション 3-6) を速やかに実行してください。この限られた時間枠のために、生きているクモを塗る前に、(練習のために) 死んだ標本を使って以下の塗装方法を試みてください。 3. クモを顕微鏡下に取り付ける 顕微鏡の視野に用意されたモデリング粘土の取り付けピンまたは釘の頭の上に非常に少量の接着剤を加えます。注: 場所にクモを維持することができます接着剤の最小量を使用して、私) クモがピンヘッドの外にスライドしないことを確認する (あまりにも多くの接着剤が使用されている場合)、および ii) クモは目覚めた後、自分自身を解放するために管理します。 麻酔をかけたクモをその腹側を上にしてテーブルの上にそっとスライドさせます。注: スパイダーの abdomens は柔らかいため、スパイダーをテーブルにタップまたはドロップしないようにして、けがの原因となる可能性があるので注意してください。 クモが適用された小さな圧力の下でわずかにバウンスし、足を伸ばすようにクモの胸骨 (クモの足が体に付着する中央の領域) 上のピンヘッド (接着剤で) をそっと押します。加えられた圧力の余分制御のために、モデリング粘土を両手で持ち、両手をテーブルにしっかりとねらう。 ペイントする領域が上向きで焦点を合わせているように、顕微鏡下でモデリング粘土の位置を変更します。 4. クモの絵を描く クモにペイントブラシに触れる前に、塗料の一貫性を評価します。 塗料の一貫性を再試験 (シンナーで維持されている場合は、吸収紙を使用してブラシを拭き取る)、必要に応じて再度調整し、常に最初にブラシヘアに含まれる塗料の量を制御するために、プリンタの用紙にペイントを適用してみてください。 右手で顕微鏡を見ながら、ブラシの先端を視界に入れ、ブラシの毛があまりにも多くのペンキを含んでいないこと (2 度目) を確認し、その場合はその一部をプリンタの紙の上に拭きます。 クモの塗料の一貫性をテストします。 ペイントする必要があります最大の領域にブラシでクモをタッチします。これは、塗料の一貫性と量が右であるかどうか (すなわち、塗料がわずかに、ゆっくりと徐々にクモの毛/スケールにしみ込む) かどうかを画家に通知します。 ペイントが適用されない場合は、ブラシをペイントに浸し、ステップ4.1 に戻って手順を繰り返します。 塗料が塗料で覆われるべきではない領域に急速にしみ込むと、こぼれが最小限であり、個体がまだ実験に参加できると仮定する場合は、吸収紙の上にブラシを拭き、ステップ4.1 に戻って繰り返します プロシージャ。注: このタイプの液体こぼれは固定できません。漏出が chelicerae または眼、またはその他の個人にとって有毒である可能性のあるその他の部分に到達した場合、それが目覚めてクモを実験から排除する前に、それを euthanize するためにすぐに冷凍庫にクモを置くことを検討してください。 ステップ4.1 と4.2 の次の色を必要とするすべての領域をペイントします。 スパイダーの顔をペイントする場合は、左手で余分な細いピンを使用して、前脚と pedipalps を押さえます (ペイントの邪魔にならないようにします)。これは、クモの付属器の損傷を避けるために顕微鏡を通して見ながら行うのが最善です。また、クモの顔を塗る場合、そして、ペイントするために使用されるブラシに応じて、目の間の中央部分をペイントしようとする前に、顔の両側を塗ることを検討してください-両方の塗装領域は、クモの顔に平行にブラシを保持することによって接合することができます毛管作用を誘導する。注: クモの顔を塗るときは、最初に利き手に最も近い側をペイントしてから、顕微鏡の下にある粘土の球を回転させて反対側をペイントし、続いて真ん中を描くのが最も簡単です。 Pedipalps や脚をペイントするときは、塗料が硬化している場合 (エナメル塗料など)、関節に触れないように注意し、男性の精子送達器官 (pedipalps の遠位セグメントの下側) には塗料を塗布しないようにしてください。 5. クモの絵を撮る 目的をカメラモードに切り替えます。 コンピュータソフトウェアを使用して写真を撮影し、選択したズームが顕微鏡で選ばれたものであることを確認し、スケールバーを追加することができます。 6. ピンまたは釘からクモを離す クモが動き出すと、クモの前脚がクモのバイアルに触れているようにピンを持ちます。 クモがそれ自体を解放してみましょう、と必要であれば、クモが乾燥接着剤から離れて自分自身を引っ張るのを助けるために、慎重にピンを傾けます。 絵が完成する前にクモが目覚めた場合, クモは再び麻酔される前に回復するために、少なくとも15分を許可します.これが行われる場合、すべてのグループが同じ麻酔レベル (該当する場合は、偽治療された個体を含む) を得ることを確認します。注意: クモは、操作後急速に正常な行動を再開するように見えます (< 15 分) しかし、我々は行動試験でスパイダーを使用する前に12時間の標準化休息時間をお勧めします。 7. クモの行動の分析 Unmanipulated、シャム処理、および操作された被験者の行動を比較して、アプリケーションの潜在的な毒性 (特定の塗料の種類、色、応用領域、および研究種によって異なる場合があります) を評価します。比較対象となる行動には、活動率、実行された活動の種類、特定の活動の実行における成功 (例えば、獲物の捕獲) などがあります。 制御しながら個々の色を変更するために (例えば、非可視領域上の塗料アプリケーションを受信したり、同じ領域に適用される中間色の塗料を持っている) 実験計画の一部として、偽処理されたクモを使用しますその他の要因 (例えば、処理時間、臭気、表面の質感など)。注: 脚または pedipalps を塗装する場合、これが感覚毛 (スパイダーレッグおよび pedipalps で流行している、Foelix 201040を参照) と干渉する可能性があることを考慮し、これらの場合には、偽治療の男性には中性色の塗料を塗布する必要があります。コントロールと同じ領域。 新しいメソッドを開発するときは、ペイントされたスパイダーと unmanipulated スパイダーを比較して、カラー操作の個人がまだ正常に動作するかどうかを評価します。 8. 塗装された被写体に対する色操作の反射率特性の測定 一度安楽死 (クモが実験に関与した後、またはこの目的のために具体的に安楽死された後、下記の注を参照)、標準的なポータブル UV VIS 分光光度計 (材料の表) を使用して色操作のスペクトル特性を測定)、特に直径1mm より大きい領域については。 小さいエリアでは、より簡単でより正確な測定のために特注の microspectrophotometer (UV-VIS 分光光度計) を使用して、顕微鏡の光学系は UV 光をカットしますが、測定はヒト可視波長 (テイラー et al. 201141参照)。 色操作された領域が非常に小さく、UV 反射率データが必要な場合は、市販の UV VIS microspectrophotometers を使用しますが、それらはより高価です (テイラー et al. 201442を参照)。注: UV VIS 分光光度計の光源には、UV 光が含まれており、動物の目 (私たちを含む) に危険なことがありますので、スペクトルの測定は、動物を安楽死させ、単に麻酔をしないで行う必要があります。エナメルで塗られたクモの場合、これは、塗料が磨耗しないので、クモが実験に使用した後に行うことができます (以下の代表的な結果を参照)。数日または数週間後にフェードすることがある水性塗料の場合、スパイダーのセットは、それらの対が実験に関与するときに測定のために犠牲にすることができる (実際の色操作を反映するデータをキャプチャするために実験)。塗料のスペクトル特性を報告することは、色操作を複製したいと思うかもしれませんが、同じ特定の塗料製品へのアクセス権を持っていない他の研究者による複製を可能にします。