Vuxen mus siffra amputation och regenerering: en enkel modell för att undersöka bildandet av BLASTEMA hos däggdjur och Intramembranös ossifiering

Däggdjur, inklusive människor och möss, har kapacitet att regenerera tips av sina siffror efter distala amputation av terminalen falangen (P3)^1,2,3. I möss är regenereringssvaret amputation-nivå-beroende; alltmer proximala amputationer visar ett progressivt försvagat regenerativt svar tills fullständig regenerativ svikt vid amputationer transekera och proximalt till P3-Nagel matrisen^{4,5,6 , 7 , 8}. P3 Regeneration medieras av bildandet av en BLASTEMA, definierad som en population av prolifererande celler som genomgår morfogenes för att återskapa de amputerade strukturerna⁹. Bildandet av en embryon att regenerera strukturer förlorade genom amputation, en process som kallas epimorfiska förnyelse, skiljer multi-vävnad-nivå P3 förnyelse svar från traditionell vävnad reparation efter skada^{6, 10}. P3 regeneration är en reproducerbar och processuellt enkel modell för att undersöka komplexa regenerativa processer inklusive sårläkning^11,12, ben histolys^11,12, revaskularisering¹³, perifer nervregeneration¹⁴, och blastemal omvandling till ben via intramembranös ossifikation¹⁵.

Tidigare studier med immunohistokemi har visat att embryon är heterogena, avaskulära, hypoxiska, och mycket proliferativ^11,13,15,16. Efter den distala P3-amputation associeras tidigt embryon initialt med P3 periostet och endosteum och kännetecknas av robust proliferation och begynnande osteogenes i anslutning till ben ytan¹⁵. Efter bennedbrytning och sår stängning bildas den heterogena embryon genom sammanslagning av periostal och endosteal-associerade celler, följt av differentiering av blastemal komponenter inklusive ben via intramembranös ossifikation ¹⁵.

Ben reparation som svar på skada uppstår vanligen genom endochondral benbildning, dvs via en initial brosk förhårdnader som bildar en mall för efterföljande benbildning^17,18. Långa ben intramembranös ossifikation, dvs benbildning utan en brosk intermediär, är vanligen induceras med hjälp av komplexa distraktion enheter eller kirurgisk fixering^19,20. Siffran regenereringsrespons är en preklinisk modell som erbjuder fördelar jämfört med konventionella intramembranösa benbildning modeller: 1) det kräver inte yttre eller inre fixering efter skada för att stimulera intramembranös benbildning, 2) det är utförs med 4 siffror från varje djur, vilket maximerar prover samtidigt minimera djuranvändning, och 3) sekventiell in vivo mikrodatortomografi (μCT) analys kan utföras med lätthet och hastighet.

I den nuvarande studien visar vi det standardiserade P3-amputation-planet för att uppnå ett reproducerbart och robust regenereringssvar. Dessutom, vi visar en optimerad fluorescens immunohistokemi protokoll med paraffin sektioner för att visualisera embryon bildning, revaskularisering i samband med förnyelse, och blastemal omvandling till ben via Intramembranous Förbening. Vi visar också användningen av sekventiell in vivo μCT för att identifiera förändringar i ben morfologi, volym och längd i samma siffra under regenereringen. Målet med detta protokoll är att undersöka bildandet av embryon från däggdjur efter amputation och att demonstrera 2 tekniker, fluorescensimmunohistokemi och sekventiell in vivo μct, för studiet av intramembranös ben förnyelse.