Aqui, nós apresentamos um protocolo da amputação terminal adulta do falange do rato para investigar a formação mamífero do blastema e a ossificação intramembranosos, analisadas pelo immunohistochemistry fluorescente e pelo tomography microcomputado in-vivo seqüencial.
Aqui, nós apresentamos um protocolo da amputação terminal distal do falange (P3) do rato adulto, um modelo mamífero processualmente simples e reprodutível da regeneração epimórfica, que envolve a formação do blastema e a ossificação intramembranosos analisadas por Immunohistochemistry da fluorescência e tomography microcomputado in-vivo seqüencial (μCT). A regeneração dos mamíferos é restrita a amputações que transecting a região distal do terminal falange (P3); os dígitos amputados em uns níveis mais proximal não conseguem regenerar e submeter-se à cura fibrótica e à formação da cicatriz. A resposta de regeneração é mediada pela formação de um blastema proliferativo, seguido pela regeneração óssea via ossificação intramembranosa para restaurar o comprimento esquelético amputado. A amputação P3 é um modelo pré-clínico para investigar a regeneração epimórfica em mamíferos, e é uma ferramenta poderosa para o projeto de estratégias terapêuticas substituir a cura fibrótica com uma resposta regenerativa bem sucedida. Nosso protocolo usa a imunohistoquímica de fluorescência para 1) identificar populações de células de blastema precoces, 2) revascularização do estudo no contexto da regeneração e 3) investigar a ossificação intramembranosa sem a necessidade de osso complexo dispositivos de estabilização. Também demonstramos o uso de μCT sequencial in vivo para criar imagens de alta resolução para examinar as alterações morfológicas após a amputação, bem como quantificar mudanças de volume e comprimento no mesmo dígito ao longo da regeneração. Nós acreditamos que este protocolo oferece a utilidade tremenda para investigar epimórfica e respostas regenerativa do tecido nos mamíferos.
Os mamíferos, incluindo humanos e camundongos, têm a capacidade de regenerar as pontas de seus dígitos após a amputação distal da falange terminal (P3) 1,2,3. Em camundongos, a resposta de regeneração é dependente do nível de amputação; As amputações cada vez mais proximal do dígito exibem uma resposta regenerativa progressivamente atenuada até a falha regenerativa completa em amputações que transecting e proximal à matriz de prego P34,5,6 , 7 anos de , 8. a regeneração P3 é mediada pela formação de um blastema, definido como uma população de células proliferantes que passam por morfogênese para regenerar as estruturas amputadas9. A formação de um blastema para regenerar as estruturas perdidas pela amputação, um processo denominado regeneração epimórfica, distingue a resposta de regeneração P3 de nível multitecidual do reparo tecidual tradicional após a lesão6, 10. a regeneração P3 é um modelo reprodutível e proceduralmente simples para investigar processos regenerativos complexos, incluindo cicatrização de feridas11,12, histólise11,12, revascularização13, regeneração periférica14do nervo, e conversão de blastemal ao osso através da ossificação intramembranosos15.
Estudos prévios com imunohistoquímica demonstraram que o blastema é heterogêneo, avascular, hipóxico e altamente proliferativo11,13,15,16. Após a amputação distal do P3, o blastema precoce é inicialmente associado ao periósteo P3 e ao endoesteto e caracteriza-se por proliferação robusta e osteogênese nascente adjacente à superfície óssea15. Subseqüente à degradação do osso e ao fechamento da ferida, o blastema heterogêneo é dado forma pela fusão de pilhas periosteal e endoroubo-associadas, seguidas pela diferenciação de componentes blastemal que incluem o osso através da ossificação intramembranosos quinze anos.
O reparo ósseo em resposta à lesão ocorre tipicamente pela ossificação endocondral, ou seja, por meio de um calo cartilaginoso inicial que forma um modelo de formação óssea subseqüente17,18. A ossificação intramembranosos do osso longo, isto é, formação do osso sem um intermediário cartilaginoso, é induzida geralmente usando dispositivos complexos da distracção ou a fixação cirúrgica19,20. A resposta de regeneração de dígitos é um modelo pré-clínico que oferece vantagens sobre os modelos de ossificação intramembranosa convencional: 1) não requer lesão pós-fixação externa ou interna para estimular a ossificação intramembranosa, 2) é realizada com 4 dígitos de cada animal, maximizando as amostras e minimizando o uso de animais, e 3) a análise sequencial in vivo do tomography microcomputado (μCT) pode ser executada com facilidade e velocidade.
No presente estudo, mostramos o plano de amputação P3 padronizado para obter uma resposta de regeneração reprodutível e robusta. Adicionalmente, Nós demonstramos um protocolo aperfeiçoado da imunohistoquímica da fluorescência usando seções da parafina para visualizar a formação do blastema, o revascularização no contexto da regeneração, e a conversão blastemal ao osso através de intramembranosos Ossificação. Também demonstramos o uso de μCT in vivo sequencial para identificar alterações na morfologia óssea, volume e comprimento no mesmo dígito ao longo da regeneração. O objetivo deste protocolo é investigar a formação de blastema de mamíferos após a amputação e demonstrar 2 técnicas, imunohistoquímica de fluorescência e μCT in vivo sequencial, para o estudo da regeneração óssea intramembranosa.
Este protocolo descreve um procedimento padronizado da amputação P3 longe do ponto de origem do rato adulto, mancha immunohistochemical fluorescente para visualizar e investigar a formação do blastema e a ossificação intramembranosos, e a exploração sequencial in vivo do μct a identificar alterações morfológicas ósseas, volume e comprimento pós-amputação. A amputação P3 é um modelo único, proceduralmente simples e reprodutível para analisar um ambiente pró-regenerativo da ferida que desencadeia a fo…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos aos membros do laboratório Muneoka e do Instituto Texas de Medicina Genômica (TIGM). Este trabalho foi apoiado pelo Texas A & M University.
Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
vivaCT 40 | SCANCO Medical |