Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğunun doğru ölçülmesini yapmak için oldukça basit ve hassas bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, genetik ve çevresel değiştiricilerin etkilerini ve biliyer hastalıklarının fare modellerinde potansiyel tedavilerin etkinliğini belirlemede yardımcı olabilir.
Mouse, safra hastalıklarının incelenmesi için geniş bir model organizma olarak kullanılır. Safra sisteminin gelişimini ve fonksiyonunu değerlendirmek için, serum kimya, histolojik analiz ve spesifik belirteçleri için immünostik dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanılır. Bu teknikler safra sistemi hakkında önemli bilgiler sağlayabilse de, genellikle tüm karaciğer genelinde safra kanalı (BD) gelişimsel kusurları tam bir resim sunmaz. Bu kısmen safra gelişiminde önemli düşüklüğü olan hayvanlarda bile su drenajı için fare karaciğerinin sağlam yeteneği nedeniyle. Burada, mutant/transjenik farelerin tüm lobları kapsayan bölümlerde her portal ven (PV) ile ilişkili ortalama BDs sayısını hesaplamak için basit bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemle, ciğeri çeşitli genotürleri ve deneysel koşullar arasında karşılaştırma kolaylaştırmak için stereotifik bir şekilde monte ve kesitli. BDs, sitolatin-lekelenmiş kolanjiositlerin ışık mikroskobu ile tanımlanır ve daha sonra sayılan ve karaciğer bölümünde mevcut PVs toplam sayısına bölünmüştür. Örnek olarak, bu yöntemin vahşi tip fareler ile Alagille sendromunun fare modelini açıkça nasıl ayırt edebilmesi gerektiğini gösteriyoruz. Burada sunulan yöntem, biliyer ağacının üç boyutlu yapısını görselleştiren tekniklerin yerini alamaz. Ancak, BD gelişimini ve farelerde Ductular reaksiyon oluşumunun derecesini niceciksel olarak değerlendirmek için kolay ve doğrudan bir yol sunar.
Safra ağacı, memeliler karaciğerinin önemli bir parçasıdır ve safra, hepatositlerden bağırsak içine geçişine izin verir. İntrahepatik safra kanalları (BDS), bipotel hepatoblastlardan çentik ve tgfβ sinyal1,2ile ayırt edilen kolanjiositlerden oluşur. Uygun belirtimi ve cholangiocytes taahhüdü ve olgun BDs içine onların montaj intrahepatik safra ağacının gelişimi için önemlidir. Karaciğer gelişimi sırasında ya da organ rejenerasyonu üzerine büyüdükçe, safra sistemi uygun karaciğer drenaj sağlamak için karaciğerde geliştirilmesi gerekir. Dahası, bir dizi sendromli ve sendromic olmayan hastalıklar intrahepatik BDs3‘ ün salılarına neden olur. Buna ek olarak, akut ve kronik karaciğer hastalıklarının bir dizi karaciğerde sözde Ductular reaksiyonlara yol açtı, bu biliyer işaretçileri ifade ama mutlaka biliyer hücrelerinden veya formu ortaya çıkmaz hücrelerin önemli sayıda varlığı olarak tanımlanır Patent BDs4. Multisistem bozukluğu olan Alagille Sendromu (algs), çentik ligand jagged1 (JAG1) kötü BD oluşumu ve kolestaz5,6‘ da oluşan haployetmezlik. Laboratuvarımız, daha önce oluşturulan Jag1 heterozigot fare hattı7 ‘ nin algs8‘ de BD yetersizlik ‘nin hayvan modeli olduğunu göstermiştir. ALGS bu fare modelinde, kolanjiositler hala mevcut. Ancak, Olgun, patent BDs8içine birleşme taahhüt başarısız. Bu nedenle, BD yetersizlik bir model içinde karaciğer Analizi belirgin varlığı veya kololgiocytes yokluğunda daha fazla gerektirir. Hangi olgun BDs karaciğer mevcut derecesi doğru değerlendirmek önemlidir.
Anatomik patolojide, BD ‘nin%9‘ unda var olup olmadığını değerlendirmek için nicel Yöntemler kabul edilmektedir. Örneğin, insan hastalarında algs üzerinde çalışmalar genellikle karaciğer biyopsisi başına en az 10 Portal gemileri analiz ederek BD portalı ven (PV) oranı ölçmek9,10. Şekil ve patent BDS genel varlığı veya yokluğu analizi, serum kimya ile birlikte, fareler içinde BD gelişimi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir11,12,13. Ancak, fareler, serum bilirubin seviye8‘ de sadece mütevazı bir artış Ile BDS önemli sayıda kaybedebilir. Buna göre, PV başına mevcut olan BD ‘lerin sayısını değerlendiren bir nicel Yöntem, farelerde BD yetersizlik derecesini daha doğrudan ölçmek sağlayabilir. Son zamanlarda yapılan bir raporda, PV başına tüm karaciğer lobları boyunca BD ‘lerin sayısını ölçülebilir ve Jag1 +/– Animals8‘ de BD-PV oranındaki önemli bir azalma bildirdi. Analizimiz sırasında, inflamatuar reaksiyon ve Ductular reaksiyonları derecesine rağmen önemli bir varyasyona karşın, BD ‘ye PV oranı çok değişkenlik göstermez8. Dahası, BD ‘nin PV oranlarının ölçülmesi, Jag1 +/– hayvanların glikosyltransferaz geni Poglut1 bir kopyasını kaldırmanın BD yetersizlik8‘ i önemli ölçüde iyileştirebilmemizi sağladı. Bir Jag1 +/+ arka planda, vasküler pürüzsüz kas hücrelerinde Poglut1 koşullu kaybı, BD numaralarının ilerici bir artışla sonuçlanır, bu da mütevazı (% 20-30) P7 ama yetişkinler8önemli olur. Yine bu teknik, P7 ‘de bile bu hayvanlarda BD yoğunluğundaki artışın istatistiksel olarak önemli olduğunu göstermemize izin verdi. Not: Bu genotipteki artan BD yoğunluğu dört aydır, reçine döküm analizi ile de doğrulandı. 8 bu gözlemler ve farklı algs fare modellerinde BD yoğunluğu ölçülen diğer raporlar14,15 çeşitli mutant biliyer kusurları analiz etmek için genel stratejisine bu yöntemi birleştirmek için bize istenir ve transjenik fareler.
Burada, karaciğer hastalığının fare modellerinde BD yetersizlik derecesini incelemek için kullanılabilecek basit bir teknik ayrıntılarıyla (Şekil 1). Bu yöntemle, cholangiocyte işaretçiler Sito (CK) 8 ve CK19 (bundan sonra geniş spektrumlu CK, wsCK) ile birlikte boyama, fare karaciğerinde BDs ve uncorporated cholangiocytes görselleştirilmesi için kullanılır. Alfa-pürüzsüz Kas aksini (αSMA) karşı bir antikor etiket gemiler için boyama eklenir. Tüm karaciğer lob ‘lar kapsayan bir bölümde BD PV oranı sistematik Analizi her genotip için çok sayıda PV analiz edilmesini sağlar. Yöntemimiz 2D görüntülerde BDs ve PV ‘lerin ölçülmesi üzerine bağlı olduğundan, belirli bir mutasyonun safra ağacının 3D yapısında veya küçük safra kanallarının bütünlüğünü incelemek için uygun değildir. Yine de, müfettişlerin fareyle biliyer gelişimini değerlendirmek için basit ve objektif bir strateji sağlar.
Farelerde BD gelişimi ve onarımının incelenmesi, kolestatik bozuklukların patogenezi ve mekanizmasının incelenmesi konusunda önemli bir araçtır. Buna ek olarak, yeni tedavilerin geliştirilmesi kısmen tekrarlanabilir ve tercihen ölçülebilir fenotip kurulması üzerine bağlıdır. Fare modellerinde mevcut fenotipleme genellikle serum kimya, karaciğer histolojisi ve hücre tipi spesifik işaretçileri için immünostatik içerir. Bu teknikler biliyer sisteminin yapısı ve işlevi hakkında değerli bilgile…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Sağlık Ulusal Enstitüleri (NıH) (R01 GM084135 ve R01 DK109982), bir pilot/fizibilite Ödülü Teksas Tıp Merkezi sindirim hastalığı Merkezi NıH P30 DK56338 altında destek kabul ve bir Alagille Sendromu Hızlandırıcı Ödülü Tıp Vakfı.
Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
50mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
Macrosette | Simport | M512 | |
Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
Microtome | Microm | HM 325 | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
22×50 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |