Summary

استهداف المجاميع ألفا سينوكلين في ألياف الأعصاب الطرفية الجلدية عن طريق اختبار المناعة العائمة الحرة

Published: June 25, 2019
doi:

Summary

هنا، نقدم بروتوكولاً لفحص الفلور المناعي غير المباشر العائم الحر على أقسام خزعة الجلد التي تسمح بتحديد المتغيرات المطابقة الخاصة بالأمراض من ألفا سينوكلين المشاركة في مرض باركنسون والبروتينات المتعددة لل الجهاز العصبي المحيطي.

Abstract

حتى الآن ، بالنسبة لمعظم الأمراض العصبية لا يتوفر سوى تشخيص نهائي للتشريح. لمرض باركنسون (PD), التشخيص لا يزال يعتمد فقط على العلامات السريرية للمشاركة الحركية التي تظهر في وقت لاحق في مسار المرض, عندما يتم فقدان معظم الخلايا العصبية الدوبامينبالفعل. وبالتالي، هناك حاجة قوية إلى مؤشر حيوي يمكن أن تحدد المرضى في بداية المرض أو في خطر تطويره. على مدى السنوات القليلة الماضية، وقد ثبت خزعة الجلد لتكون ممتازة البحث وأداة التشخيص لأمراض الأعصاب الطرفية مثل الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة. ومن المثير للاهتمام، وقد أظهرت الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة وألفا synuclein (αSyn) الرواسب العصبية عن طريق خزعة الجلد في مرضى PD. في الواقع، خزعة الجلد لديه ميزة كبيرة لكونه سهل الوصول إليها، والإجراءات طفيفة التوغل وغير مؤلم الذي يسمح بتحليل الأنسجة العصبية الطرفية المعرضة لعلم الأمراض. وعلاوة على ذلك ، فإن إمكانية تكرار خزعة الجلد خلال متابعة نفس المريض تسمح بدراسة العلاقة الطولية مع تطور المرض. وضعنا بروتوكول اعدّي ّيّة يمكن الاعتماد عليه للتحقيق في وجود المجاميع αSyn في ألياف الأعصاب الجلدية لمريض PD. يتضمن هذا البروتوكول بضع خطوات تثبيت قصيرة، وتقسيم cryotome ومن ثم الفلور المناعي العائمة الحرة مزدوجة التلطخ مع اثنين من الأجسام المضادة محددة: مكافحة البروتين الجينات المنتج 9.5 (PGP9.5) للاحتفال الألياف العصبية الجلدية ومكافحة 5G4 للكشف عن αSyn المجاميع. وهو متعدد الاستخدامات وحساس وسهل الأداء البروتوكول الذي يمكن تطبيقه أيضا لاستهداف البروتينات الأخرى ذات الاهتمام في أعصاب الجلد. القدرة على وضع علامة على المجاميع αSyn خطوة أخرى إلى الأمام إلى استخدام خزعة الجلد كأداة لإنشاء تشخيص الأنسجة قبل الوفاة من PD.

Introduction

وقد اكتسبت خزعة الجلد أهمية كبيرة كأداة التشخيص والبحث في مجال الاضطرابات العصبية1. في الواقع، البشرة والأدمة تحتوي على ألياف عصبية حسية جسدية وفيرة (الميالينات وغير الميالينات)، نهايات العصب الحر nociceptive، مستقبلات الحسية والتعصيب اللاإرادي من الغدد العرقية، والأوعية، والغدد الدهنية والعضلات العاقد بيلروم 2.

في منتصف القرن العشرين، سمح الإعداد للكيمياء المناعية للالأجسام المضادة PGP9.5 بدليل على تعصيب واسع النطاق للبشرة جلد الثدييات3. PGP9.5 هو هيدرولاز كاربوكسيل محطة موزعة على قدم المساواة على طول محاور من كل من الجهاز العصبي المركزي والطرفية (PNS). توافر هذا الأجسام المضادة يسمح ليس فقط لتوضيح المورفولوجيا والتشريح من PNS في الجلد ولكن أيضا تنفيذ دراسة الأمراض المرتبطة به3,4. ساهمت خزعة الجلد في تحديد كيان سريري جديد: الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة. أظهرت عدة مجموعات دولية العلاقة بين فقدان الألياف العصبية داخل الجلد وأعراض / علامات اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة5 عن طريق تحليل خزعة الجلد وقدمت بروتوكولات موحدة لmorphometry العصب وكذلك القيم المرجعية المعيارية لاستخدامها في الممارسة السريرية6و7و8.

في الآونة الأخيرة أظهرت كمية كبيرة من الأدلة أن الأمراض العصبية، التي تتميز تراكمات البروتين المطوية في الجهاز العصبي المركزي، هي أمراض متعددة النظام9. في الواقع, يتميز PD بتراكم αSyn في الخلايا العصبية الدوبامينية من نيجرا substantia, ولكن ثبت أن αSyn وشكله المرضي, فوسفوريلاتيد αSyn (P-αSyn), يمكن الكشف أيضا في الأنسجة الطرفية. المعدة والأمعاء الغشاء المخاطي10، الغدد اللعابية11، ألياف الجلد اللاإرادي المحيطة الغدد العرقية والعضلات الحركي12،13،14، تظهر المناعة لأشكال الإمراض من αSyn ، في وفقا لافتراض براك أن يفترض بشكل مثير للاهتمام أن علم الأمراض αSyn قد تبدأ في PNS في وقت مبكر، قبل تراكمه في الدماغ15. وعلاوة على ذلك، تم إثبات وجود p-αSyn في الأعصاب الجلدية للمرضى الذين يعانون من اضطرابات السلوك REM التي تعتبر PD prodromal16،17 وبالتالي يمكن اعتبار αSyn الجلد علم الأمراض واعدة في وقت مبكر الطرفية مؤشر الأنسجة المرضية من اعتلال الخلايا النخاعية.

وقد تم إثبات ارتباط الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة في PD سابقا، وقد وجد أن كثافة الألياف العصبية داخل الجلد يعكس تطور المرض18،19. وبالتالي، فإن خزعة الجلد هي أداة مفيدة لدراسة التنكّر العصبي في PD ولإنشاء تشخيص الأنسجة قبل الوفاة للمرض. في الواقع، خزعة الجلد لديه ميزة كبيرة لكونه إجراء يسهل الوصول إليه او طفيفة التوغل، مما يسمح بتحليل الأنسجة العصبية المعرضة لعلم الأمراض. وأخيرا ، فإن إمكانية تكرار خزعة الجلد في سياق متابعة نفس المرضى يسمح بدراسة العلاقة الطولية مع تطور المرض.

في مختبرنا، واستغلال مزدوج المناعية تلطيخ مع PGP9.5 والأجسام المضادة أحادية النسيلة التطابق 5G4 محددة، التي تعترف أشكال محددة من المرض αSyn بما في ذلك المجاميع الصغيرة20،21، كنا قادرين على إظهار وجود المجاميع αSyn في الأعصاب الجلد مع كفاءة تشخيصية عالية واعدة19. تحليل الفلور المناعي لخزعة الجلد في أمراض التشكل تبرز كمصدر واعد للمؤشرات الحيوية من خلال الجمع بين كل من الكشف عن مجاميع البروتين وقياس التنكّر العصبي في الجسم الحي. فيما بعد، نوضح بروتوكولًا سهلًا ومتعدد الاستخدامات بشأن التعامل مع خزعة الجلد وأداء تلطيخ الفلور المناعي العائم الحر للكشف عن مجاميع αSyn. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لاستهداف أي بروتين آخر من الاهتمام أعرب في PNS الجلد.

وقد تم استخدام بروتوكول الدراسة التالية لتقييم فائدة التشخيص من تحليل αSyn مجمعة في PNS من PD عن طريق خزعة الجلد19. وكانت معايير الشمول للPD: تشخيص سريري واضح وفقا لمعايير التشخيص بنك الدماغ في المملكة المتحدة، ومدة المرض على الأقل 3 سنوات، لا تاريخ الأسرة، وليس ضعف الإدراك الرئيسية أو أعراض خلل التغذية الذاتية الرئيسية في التاريخ. كانت معايير الاستبعاد أسباب معروفة للاعتلال العصبي (الهيموغلوبين الغليكات، الكرياتينين، فيتامين B12، TSH، تثبيت المناعة المصل، فيروس نقص المناعة البشرية، فيروس التهاب الكبد C، الزهري، وداء البوريلي). خضع كل موضوع لخزعات الجلد قطرها 3 مم في ثلاثة مواقع تشريحية (الرقبة على مستوى C8 الجلد، الفخذ 10 سم فوق الركبة، الساق 10 سم فوق malleolus الجانبية) على الجانب، الذي كان سريريا أكثر تضررا. بشكل عام، البروتوكول التالي هو حول التعامل مع خزعة الجلد وأداء تلطيخ الفلور المناعي العائمة الحرة والتحليل. وبالتالي فإنه يمكن تكييفها واستخدامها للكشف عن البروتينات الأخرى ذات الاهتمام في أنسجة الجلد.

Protocol

وقد وافقت لجنة الأخلاقيات في الكانتونات على البروتوكول، وأعطى جميع الأشخاص المسجلين موافقة خطية مستنيرة على الدراسة. 1. مجموعة خزعة الجلد السماح للطبيب المؤهل بإجراء خزعة الجلد في بيئة سريرية مناسبة. اختر المنطقة لإجراء خزعة الجلد وتنظيفها بمسحة كحولية. إع…

Representative Results

بعد الإجراء الموصوف(الشكل1)، اكتشفنا المجاميع αSyn، وصفت مع الأجسام المضادة 5G4، في اللفافات العصبية الجلدية تشعب الهياكل اللاإرادية من المرضى PD. يظهر مورفولوجيا رواسب ألفا-سينوكلين كإشارة منقط على طول محاور الأعصابالجلدية (الشكل 2). في الواقع، استغلال هذا ال…

Discussion

نحن نوصف فحص المناعة العائمة الحرة لخزعات الجلد لتشخيص PD: فإنه يستغل الصبغ المناعي المزدوج مع الأجسام المضادة PGP9.5، علامة باناكسونال، والمضادة 5G4، وهو الأجسام المضادة التشكل محددة التي تعترف شكل مجمعة من αSyn.

المزايا الكبيرة لخزعة الجلد لغرض التشخيص في PD وربما في اضطرابات ا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر باركنسون شفايز وABREOC (المجلس الاستشاري للبحث العلمي في كانتون إنتي أوسبيدالييرو) على دعمهما المالي لهذه الدراسة.

Materials

5G4 (anti human αSyneclein 5G4) Analytik Jena Roboscreen 847-0102004001 Mouse monoclonal 
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG  Invitrogen 1971418 2mg/ml
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG  Invitrogen 1922849 2mg/ml
Disodium hydrogen phosphate solution Merk Millipore 106586
Ethylene Glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G7757
L-Lysine monohydrochloride Sigma-Aldrich L5626
Paraformaldehyde Aldrich Chemistry 441244
PGP9.5 Abcam ab15503 Rabbit polyclonal
Sodium Chloride Sigma  S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate Merck Millipore 106346
Sodium (meta)periodate  Sigma-Aldrich S1878
Trizma Base Sigma  T1503
Tryton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vectashield  Vector Laboratories H-1000 Mounting medium

References

  1. McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist’s Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
  2. Wilkinson, P. F., Millington, R. . Skin. , 49-50 (2009).
  3. Weddell, G., et al. Nerve endings in mammalian skin. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).
  4. Wang, L., et al. Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin. Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).
  5. Holland, N. R., et al. Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy. Neurology. 48, 708-711 (1997).
  6. McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).
  7. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).
  8. Provitera, V., et al. A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg. European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).
  9. Wakabayashi, K., et al. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).
  10. Ruffmann, C., et al. Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson’s disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).
  11. Lee, J. M., et al. The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).
  12. Donadio, V., et al. Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease. Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).
  13. Doppler, K., et al. Cutaneous neuropathy in Parkinson’s disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).
  14. Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson’s disease from multiple system atrophy. Brain. 138, 2310-2321 (2015).
  15. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
  16. Doppler, K., et al. Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).
  17. Antelmi, E., et al. Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder. Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).
  18. Nolano, M., et al. Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study. Acta Neuropathologica. , (2018).
  19. Melli, G., et al. Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).
  20. Kovacs, G. G., et al. Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread. Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).
  21. Kovacs, G. G., et al. An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology. Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).

Play Video

Cite This Article
Vacchi, E., Pinton, S., Kaelin-Lang, A., Melli, G. Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay. J. Vis. Exp. (148), e59558, doi:10.3791/59558 (2019).

View Video