Erken gelişim sırasında deniz anemon Genotipleme
Summary
Bu protokolün amacı, embriyo ödün vermeden gastrasyon sırasında deniz anemone nematostella vectensis genotip etmektir.
Abstract
Burada açıklanan, hayvan hayatından ödün vermeden anthozoan Genus nematostella vectensis gastrula sahne embriyo genotip için PCR tabanlı bir protokoldür. İn vitro fertilizasyon ve de-jellying takipte, zygotların erken-orta gastrula aşamasına ulaşmak için oda sıcaklığında 24 saat gelişmesine izin verilir. Gastrula embriyoları daha sonra deniz suyu içeren bir petri çanak agaroz jel yatağa yerleştirilir. Diseksiyon mikroskop altında, bir tungsten iğne cerrahi olarak her embriyonun bir aboral doku parçası ayırmak için kullanılır. Cerrahi sonrası embriyolar daha sonra iyileşmeye ve gelişmeye devam etmesine izin verilir. Genomik DNA izole doku parçasından çıkarılır ve Locus özel PCR için bir şablon olarak kullanılır. Genotip, PCR ürünlerinin boyutuna göre veya ALLELE özel PCR ürünlerinin varlığı/yokluğunda tespit edilebilir. Cerrahi sonrası embriyolar daha sonra genottipe göre sıralanır. Tüm Genotipleme sürecinin süresi, taramalı embriyo sayısına bağlıdır, ancak minimal 4 – 5 h gerektirir. Bu yöntem embriyoların genetik olarak heterojen bir nüfusundan nakavt mutantları tanımlamak için kullanılabilir ve gelişim sırasında fenotiplerin analizlerini sağlar.
Introduction
Cnidarians denizanası, mercanlar ve deniz anemonlar içeren hayvanların çeşitli bir grup temsil eder. Bunlar, ekstrasellüler matris (mesoglea) ile ayrılan ektoderm ve endoderm ‘den oluşan diploblastlar. Cnidaria, Drosophila ve mus gibi geleneksel hayvan modellerinin1‘ e ait olduğu Bilateria için bir kardeş grubudur. Ayrıca, Cnidaria-Bilateria sapma pre-Cambrian döneminde oluştuğu düşünülmektedir2. Bu nedenle, cnidarians ve bilatyalılar karşılaştırmalı çalışmalar en son ortak atalarının biyoloji içine anlayış kazanmak için önemlidir. Son zamanlarda, karşılaştırmalı genomikler, cnidarians ve bilatozların notch ve bhlh gibi birçok gelişimsel araç genlerini paylaşımının, ortak atalarının zaten bu genler olduğunu ima ettiğini açıkladı3. Ancak, Cnidaria ve Bilateria ‘nın son ortak atalarında bu gelişimsel araç genlerinin rolü göreceli olarak daha az iyi anlaşılmaktadır. Bu sorunu gidermek için, cnidarians içinde bu derinden uyumlu genlerin nasıl işledik çalışması önemlidir.
Gelişen Genus genetik modellerinden biri anthozoan nematostella vectensis ‘dir. Genomu3sıralanmıştır ve morpholino-aracılı gen taklası, meganuclease-aracılı Transgenesis ve Crispr-Cas9-aracılı gen tokmağı ve knockouts dahil olmak üzere çeşitli genetik araçlar, şimdi bu hayvanın kullanımı için kullanılabilir. Buna ek olarak, Nematostella gelişimi nispeten iyi anlaşılır. Embriyogenyon sırasında, gastrasyon invaginasyon tarafından oluşur4, ve embriyo serbest yüzme Planula larva içine gelişir. Planula daha sonra bir ağız ve circumoral dokunacles ile bir sapsız polip dönüşür. Polip sonra büyür ve cinsel olgunluğa ulaşır.
Crispr-Cas9-aracılı hedeflenen Mutagenezi artık rutin olarak nematostella vectensis5,6,7,8,9‘ da gen fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Nematostella‘da nakavt mutantlar oluşturmak için, Locus ‘a özgü tek kılavuzluk Rnas ve endonükleaz Cas9 proteini içeren bir kokteyl, ilk olarak gösteren F0 kurucusu hayvanları üretmek için döllenmez veya döllenmiş yumurtalara enjekte edilir Mozaik. F0 hayvanlar daha sonra cinsel olgunluğa yükseltilmiş ve bir F1 nüfus üretmek için birbirleri ile geçti, bir alt kümesi hangi nakavt mutantlar6olabilir. Alternatif olarak, cinsel olgun F0 hayvanlar F1 heterozigot hayvanlar oluşturmak için vahşi tip hayvanlar ile geçilebilir ve faiz Locus içinde bir nakavt allel taşımak F1 heterozigotlar daha sonra F2 yavru üretmek için birbirleri ile kesişebilir, bir çeyrek Hangi nakavt mutantlar5bekleniyor. Her iki yaklaşım da genetik heterojen bir nüfusun nakavt mutantları tanımlamak için bir yöntem gerektirir. Polyp tentacles Genotipleme için genomik DNA ayıklamak için kullanılabilir6,7. Bununla birlikte, ilgi geninin gelişimsel fonksiyonunun incelendiği ve mutant embriyoların polip aşamasına ulaşamayacağı durumlarda (yani, mutasyona bağlı larva saflığı nedeniyle), nakavt mutantların ontojende erken tespit edilmesi gerekir. Burada açıklandığı gibi, hayvan ödün vermeden gastrula aşamasında genotip bireysel hayvanlar için PCR tabanlı bir protokoldür, bu embriyo genetiği heterojen bir nüfusun nakavt mutantların tanımlanması sağlar. Tüm Genotipleme sürecinin süresi, taramalı embriyo sayısına bağlıdır, ancak minimal 4-5 h gerektirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tanımlanan bir PCR tabanlı protokol genotip tek bir deniz anemone embriyo hayvan ödün vermeden. Yumurtlama ve de-jellying takiben, döllenmiş yumurtaların gastrulae içine gelişmesine izin verilir. Her gastrula embriyo aboral bölge cerrahi olarak kaldırılır ve izole aboral doku sonraki genomik DNA ekstraksiyon için kullanılır, kalan cerrahi sonrası embriyolar iyileşmek ve gelişmeye devam ederken. GDNA ekstraları daha sonra her embriyonun genotipini belirlemek için bir PCR tahlil için kullanıl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazının önceki versiyonunda anonim yorumcular için teşekkür ederiz, bu da taslağı geliştirdi. Bu çalışma Arkansas Üniversitesi ‘nden fon tarafından destekleniyordu.
Materials
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
