Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8⁺ específicas do tumor

Células t CD8⁺ convencionais (t_CD8) desempenham partes importantes na vigilância imune anticâncer. Eles funcionam principalmente na capacidade de linfócitos T citolíticos (CTLs) que reconhecem antígenos de peptídeos específicos do tumor ou associados (AGS) exibidos dentro da fenda fechada das moléculas de classe I do complexo de histocompatibilidade principal (MHC). CTLs totalmente armados utilizam seu arsenal citotóxico para destruir células malignas. O anticâncer T_CD8 pode ser detectado na circulação ou mesmo dentro de massas primárias e metastáticas de muitos pacientes com câncer e animais portadores de tumor. No entanto, muitas vezes são anérgicos ou esgotados e não conseguem erradicar o cancro. Portanto, muitas modalidades imunoterapêuticas são projetadas para aumentar as frequências T_CD8 anticâncer e para restaurar e impulsionar suas funções.

As proteínas tumorais abrigam muitos peptídeos, alguns dos quais podem ser imunogênicos e potencialmente imunoprotetores. Entretanto, as respostas T_CD8 quantificáveis são eliciadas com magnitudes variáveis contra poucos peptídeos. Isso cria uma “hierarquia de imunodominância” entre os clones T_CD8 ¹. Consequentemente, o imunodominante (ID) T_CD8 ocupa fileiras hierárquicas proeminentes, que é julgada geralmente por sua abundância. Em contraste, células T_CD8 cujo receptor de célula t (TCR) é específico para epítopos SUBDOMINANTES (DP) ocorrem em freqüências mais baixas. Nós e outros identificamos alguns dos fatores que ditam ou formam a imunodominância em respostas T_CD8 . Estes incluem, entre outros, a modalidade da apresentação do AG ao T_CD8 ingênuo (isto é, apresentação direta, Cruz-apresentação, cross-dressing)^2,3,4, o tipo de pilhas AG-apresentando (APCs) participando da ativação T_CD8 ⁵, a abundância e estabilidade de proteínas AGS 6,7 e a eficiência e cinética de sua degradação por proteasomas^7,8, o seletividade relativa do transportador associada ao processamento de AG (TAP) parapeptídeos⁹, a afinidade de peptídeos liberados para moléculas de MHC I^9,10, a presença, as frequências precursoras e a diversidade de TCR de cognato t_CD8 em pools de células t^11,12,¹³, Cross-Competition entre as células t para acesso a APCs¹⁴,¹⁵, e a capacidade fratricida de T_CD8 dos clones¹⁶. Além disso, a imunodominância T_CD8 é submetida a mecanismos imunoregulatórios mediados por vários tipos de células supressoras, tais como células t regulatórias de ocorrência natural (ntreg)¹⁷, a molécula de superfície celular co-inibitória programada óbito-1 (PD-1)¹⁶, e certas enzimas intracelulares como a indolamina 2,3-dioxigenase (ido)¹⁸ e o alvo de mamíferos de rapamicina (mTOR)¹⁹. É importante notar, no entanto, que os fatores acima nem sempre respondem totalmente à imunodominância.

Aparte da biologia básica do immunodominance de T_CD8 , a examinação deste fenômeno intrigante tem implicações importantes na imunologia e na imunoterapia do cancro. Primeiramente, um status da identificação não confere necessariamente em cima de um clone dado de T_CD8 a habilidade de impedir a iniciação ou a progressão do tumor²⁰. Se e como a identificação e o SD T_CD8 contribuem à imunidade antitumoral podem depender do tipo e da extensão da malignidade e do sistema experimental empregado. Em segundo lugar, acredita-se que os clones de ID T_CD8 podem ser “muito visíveis” para o sistema imunológico e^{, consequentemente,}mais propensos a mecanismos de tolerância central e/ou periférica^,16,21. Em terceiro lugar, os tumores heterogênicos podem conter as pilhas neoplásticas que evitam a deteção por muitos, se não a maioria, CTLs indicando somente um espectro estreito dos complexos do peptide: MHC. estas circunstâncias, as respostas de T_CD8 da amplitude insuficiente são prováveis ter recursos para tais pilhas do tumor uma vantagem da sobrevivência, assim potenciando seu conseqüência²². É pelas razões acima que muitos a imunodominância da vista como um obstáculo ao sucesso T_CD8-baseou a vacinação e as terapias de encontro ao cancro.

A inoculação de camundongos C57BL/6 com vírus Simian 40 (SV40)-células transformadas que expressam grande tumor AG (T AG) fornece um poderoso sistema pré-clínico para estudar imunodominância T_CD8 . Este modelo oferece vários benefícios. Primeiramente, os epítopos peptídicos desta oncoproteína clinicamente relevante são bem caracterizados nesta cepa do camundongo²³ (tabela 1). Segundo, os epítopos de T AG, que são chamados de sites I, II/III, IV e V, ativam as respostas T_CD8 que são consistentemente organizadas na seguinte ordem hierárquica: site iv > > site i ≥ site II/iii > ≫ site V. consequentemente, o local IV específico t_CD8 montar a resposta mais robusta para T AG. Em contrapartida, os sítios I e II/III são subdominantes, e o T_CD8 específico do sítio V é menos abundante e geralmente apenas detectável na ausência de responsividade a outros epítopos^23,24. Em terceiro lugar, a linha celular T AG⁺ tumoral utilizada no protocolo aqui descrito, ou seja, células fibrosarcoma C57SV, e aquelas utilizadas em nossas investigações prévias^{16, 17},^{18,19 ,25,26}, são transformados com fragmentos de SV40 subgenômica²⁵. Conseqüentemente, são incapazes de montar e liberar os virions SV40 que poderiam potencialmente infectar APCs do anfitrião. Além disso, as células C57SV são desprovidas de moléculas coestimulatórias clássicas como CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) e CD137 ligantes (4-1BBL)¹⁶. Os atributos acima tornam estas linhas ideais para o exame de in vivo T_CD8 ativação via Cross-priming. O priming cruzado é um caminho importante na indução de respostas T_CD8 , especialmente aquelas lançadas contra células tumorais de origem não hematopoiética que falham diretamente em Prime as células t ingênuas²⁵.

As frequências e/ou funções antitumorais T_CD8 podem ser monitoradas pela coloração de tetrâmero de MHC I, coloração intracelular para citocinas efetoras (por exemplo, interferão [IFN]-γ) ou moléculas líticas (por exemplo, perforina), ensaios imunoenzimáticos (ELISPOT) e ex ensaios de citotoxicidade vivo. Desde a sua criação nos anos 1990^27,28, carboxyfluoresceína éster succinimidil (CFSE)-com base em ensaios de matança in vivo permitiram a avaliação de respostas citotóxicas mediadas por CTLs antiviral^{29,30 , 31}, CTLs antitumoral^16,32, pilhas naturais do assassino (NK)³³, pilhas naturais invariantes de glycolipid-reactivas do assassino T (iNKT)³⁴, e preexistente e de novo doador-específico dos aloanticorpos²⁶. Conseqüentemente, suas aplicações podem ser do interesse a um Readership largo, incluindo mas não limitado aos investigadores que trabalham nas áreas da imunologia do tumor e da imunoterapia, da imunidade do antipatógeno, e do projeto preventivo e terapêutico da vacina.

Para avaliar a citotoxicidade mediada por células em cenários típicos, duas populações de esplenócitos ingênuos que exibem um AG irrelevante ou um cognato AG (s) são rotulados com duas doses diferentes de CFSE, misturadas em números iguais e injetadas em ingênuo (controle) ou assassino ratos abrigando células. A presença/ausência de cada população-alvo é então examinada por citometria de fluxo.

Temos otimizado e empregado in vivo ensaios de matança em nossos estudos sobre imunodominância em ambas as respostas antiviral e antitumoral T_CD8 ^12,16,17. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a avaliação simultânea de respostas do ID e do SD T_CD8 aos Epitopes de t AG, que podem prontamente ser adotados para investigações similares em outros sistemas experimentais. Nós igualmente fornecemos os resultados representativos que demonstram que o esgotamento da pilha de nTreg e o bloqueio PD-1 podem seletivamente realçar a citotoxicidade_CD8-induzida da identificação t_CD8-e do SD t, respectivamente. No final, discutiremos várias vantagens de ensaios de matança in vivo, bem como algumas de suas limitações inerentes.