셀 무료 단백질 식을 사용 하 여 빠르게 성장 박테리아 비 브리 오 natriegens

1. natriegens 대 원유 셀 추출-세균성 문화의 준비 Natriegens 대 세균 성장 미디어 파운드-v 2 표 1에 따라 준비 합니다. 압력가 마로 소독 하 여 성장 매체를 소독. 미디어 실 온 (RT)에 도달 하실 수 있습니다. 실시간에서 초과 미디어 저장주의: 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 하 고 때 압력솥 연구소 특정 지침을 참조 하십시오. Natriegens 대 야생 타입의 글리세롤 재고를 사용 하 여 파운드 V2 미디어의 3 mL 접종 하. 하룻밤 30 ° C에 225 rpm에서 떨고 있는 동안 성장 한다. 결과 펠 렛을 방해 하지 않고 1 분 Aspirate는 상쾌한 대 벤치탑 분리기에 10600 x g 에서 원심 분리 하 여 1 mL의 숙박 문화를 세척 하 고 신선한 파운드-V2 미디어의 1 mL에 resuspend. 압력가 4 L 살 균 커버, 당황 하 고 삼각 플라스 크 1 L 신선한 파운드-V2 성장 매체의 추가. 씻어 하룻밤 문화 (1:1, 000 희석 비율) 1 mL를 사용 하 여 접종. 225 rpm에서 떨고 있는 동안 30 ° C에서 문화를 성장.참고: 문화 동 natriegens 1:1,000 희석 비율을 유지 하면서 위 또는 아래로 확장할 수 있습니다. 예를 들어 250 μ L 2에 신선한 파운드-V2 성장 매체의 250 mL을 씻어 하룻밤 문화의 멸 균 커버 삼각 플라스 크를 당황 하 게 추가 합니다. 문화권의 OD600 는 분 광 광도 계를 사용 하 여 모니터링 합니다. 문화에 세600 를 도달 하는 때 = 1.0 ± 0.2, 4 ° c.에 20 분 동안 3500 x g 에서 원심 분리를 통해 수확 문화 얼음에 펠 릿을 놓습니다.참고: Natriegens 대 자 랍니다, 그래서 문화의 가까운 모니터링 하는 것이 필요. OD600 성장 = 1.0 1:1,000 희석 비율에 약 1.5−2 h를 취해야 한다. 상쾌한 발음 즉시-80 ° C에서 결과 세균성 펠 릿 저장 하거나 2 절에서 설명 하는 세포를 세포를 직접 진행 합니다.참고: 이 단계는 좋은 멈추는 포인트; 그러나, 펠 릿 또는 최상의 결과 위해 1−2 일 이내 즉시 처리할 수 하는 것이 좋습니다. 2. natriegens 대 원유 셀 추출-세포 세포의 용 해의 준비 S 30 표 1 살 균 이온된 (DI) 수에 따라 세포의 용 해 버퍼를 준비 하 고 pH 7.7 빙 초 산을 사용 하 여를 조정 합니다.주의: 빙하 아세트산 pH를 조정할 때 적절 한 보호구와 함께 처리 되어야 합니다. 약 4 ℃ 냉장고에서 또는 세포 세포의 용 해 절차를 시작 하기 전에 얼음에 멋진 S30 세포의 용 해 버퍼입니다.참고: 빠른 쿨 다운, 세포의 용 해 버퍼는-20 ° c.에 배치 될 수 있습니다. 고정 버퍼를 허용 하지 않습니다. 10−20 분 또는 완전히 해 동 때까지 얼음에 셀 펠 릿을 놓습니다. 차가운 S30 세포의 용 해 버퍼의 10 mL를 사용 하 여 동일한 1 L 문화에서 발생 하는 모든 펠 릿 resuspend 다음 현 탁 액 50 mL 튜브에 전송 합니다. 펠 릿-80 ° c 단계 1.6에서에서 냉장고에서 동결 되지는 경우 물의 resuspension 직접 진행 합니다.참고: S30 세포의 용 해 버퍼 처음 필요에 따라 펠 릿을 resuspend 하는 데 사용의 볼륨을 증가. 3500 x g 4 ° c.에서 10 분 원심 분리기 정지 펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음. 워시 펠 릿 찬 S30 세포의 용 해 버퍼의 10 mL를 사용 하 여 두 번째 시간. 얼음에 펠 릿을 놓습니다. 추운 방에 찬 S30 세포의 용 해 버퍼의 500 μ 50 mL 튜브에 펠 릿을 추가 합니다. 넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여, 펠 릿 resuspend 하 고 신중 하 게 전체 펠 릿 현 탁 액 2 mL 튜브에 전송.참고: 넓은 구멍 피 펫은 사용할 수 없습니다, 증가 펠 릿 전송 위한 구멍을 1 mL 피 펫 팁의 끝을 잘라가 위를 사용 하 여. 볼륨; 크게 증가 하지 않고 최대한 많은 펠 릿을 전송 그러나 균질 성 현 탁 액 2 mL 튜브에 의해 표시 된 대로, 펠 릿 sonicated 수에 충분 한 액체 resuspended 한다. 2 mL 튜브를 넣 하지 마십시오. 현 탁 액 1.5 mL;을 초과 해서는 안 필요한 경우 여러 개의 튜브로 분할. 얼음에 셀 펠 릿을 유지 하 고 추운 실내에서. 얼음으로 600 mL 비 커를 얼음. 위에 2 mL 튜브 홀더를 배치참고: 펠 릿 정지 쥡니다 진행 상황을 모니터링할 얼음에서 볼 수 있도록, 비 커의 측면 근처 튜브 홀더를 도움이 된다 ( 그림 1참조). 소용돌이 셀 균질에 짧게 2 mL 튜브에 펠 릿을 중단, 영화 튜브, 뚜껑의 하단에 있는 세포를 제거 하 고 모자와 튜브 홀더를 엽니다. 그것은 액체 표면 바로 아래 서 스 펜 션으로 낮은 sonicator 팁. ⅛ 인치 팁 직경 sonicator 및 프로브를 사용 하 여 그림 2 에서처럼 쥡니다 설치를 준비 합니다. Sonicator 컨트롤에 다음과 같은 설정을 입력: 20 kHz 주파수 및 50% 진폭, 펄스 시간: 10 s, 펄스 OFF 시간: 60 s. 3 사이클 펄스 쥡니다 프로토콜을 실행 합니다. 펠 렛 서 스 펜 션의 총 볼륨 > 500 μ 인 경우 펄스 쥡니다 프로토콜 6 번을 실행 합니다.참고: 일반적으로, 3−6 펄스는 natriegens 대 펠 릿; lyse 충분 추가 펄스 sonicator 따라 필요할 수 있습니다. 쥡니다, 동안 조정 손잡이 플랫폼을 사용 하 여 프로브 튜브의 바닥에 침전 할 수 있습니다 어떤 펠 릿을 lyse를 아래로 이동. 튜브 홀더 고에서 짧게 vortexed 다시 펄스 사이 정지 균질을 제거할 수 있습니다. Sonicated 셀의 원하는 일관성에 대 한 토론 아래 참조.주의: Sonicator 활성화 될 때 적절 한 청력 보호를 착용 하십시오. 쥡니다, 다음 원심 분리기 조 세포 30−45 분 또는 lysate 그림 3에서처럼 어떤 세포질 파편 든 지 무료입니다 때까지 4 ° C에서 16000 x g 에서 추출 합니다. 차가운 방에서 새로운 2 mL 튜브에 펠 렛을 방해 하지 않고 결과 supernatants의 aliquot 50 μ.참고: 새로운 2 mL 튜브에 실수로 전송 되는 어떤 파편 든 지 크게 높은 저조한 단백질 합성에 대 한 추출의 용량을 줄일 것입니다. 필요한 경우, 설정 옆으로 별도 2 mL에 후 세포 단백질 정량화에 대 한 셀의 10 μ 추출 튜브 (단계 아래 2.13 참조). 플래시 튜브 홀더에 찍기 문자열 그림4에서와 같이 연결 된 튜브를 배치 하 여 원유 셀 추출 물을 동결. 액체 질소를 포함 하는 Dewar에 튜브를 잠수함을 즉시 사용까지-80 ° C에서 냉동 실에 두십시오.주의: 얼굴 방패, 제 앞치마와 장갑, 안전 안경, 연구실 코트를 포함 하 여 액체 질소를 처리 하기 위한 적절 한 보호구를 사용 합니다. 필요에 따라 계량 lysate 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에서 샘플 1: 100 희석 Bradford 분석 실험, bicinchoninic 산 같은 모든 표준 총 단백질 정량화 분석 결과 사용 하 여 단계 2.11.1 제외 설정 10 μ를 사용 하 여 셀의 총 단백질 분석 결과 (BCA), 등입니다. 3. 셀 무료 반응 구성 요소 준비 일반적인 반응의 구성 요소 각각 100 m m와 2000 m m의 농도에서 살 균 디 물 50 mL 튜브에 Mg-조미료 및 K-조미료 일 주식을 준비 합니다. 250 mL 비 커에 물 100 mL의 멸 균 디를 추가 하 여 50% (w/v) 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)-8000의 작업 주식을 준비 합니다. 비 커에 작은 자력을 놓습니다. 그리고 말뚝-8000의 50 g으로 무게 비 커에 물 100 mL에 추가. 100 ° C로가 열된 볶음 판 설정에는 비 커를 놓고 못-8000은 솔루션에까지 250 rpm에서 저 어. 나무 못 8000 50 mL 튜브에 전송 하기 전에 냉각 액체 혼합물을 허용 한다. 에너지 솔루션 마스터 믹스 살 균 디 물 500 mL에 코 펠 릿의 140 g를 추가 하 여 코의 5 M 솔루션을 준비 합니다.주의: 화학 후드에이 솔루션을 준비 하 고 강력한 베이스를 처리할 때 보호구 착용. 그래서 병 뚜껑 압력 형성을 방지 하는 느슨한 해야 솔루션 뜨거운 될 것 이다. 사용 하기 전에 RT 도달 코 솔루션을 허용 합니다. 100 mL 병 HEPES 20.85 g를 추가 하 여 1750 mM HEPES 코 버퍼를 준비 합니다. 볼륨 40 mL에 도달할 때까지 천천히 살 균 디 물을 추가 합니다. 소용돌이 HEPES 해산 병. 5 M 코 솔루션을 사용 하 여 pH 8.0에 조정 하 고 다음 솔루션 볼륨 50 mL를가지고.주의: 코는 pH를 조정할 때 적절 한 보호구와 함께 처리 되어야 합니다. 에너지 마스터 혼합 살 균 디 물에 표 2 에 표시 된 농도에서 주식 구성 요소 x 나머지 10을 준비 하 고 얼음에 각 주식을 배치. RT와 얼음에 장소에서 100 m m ATP와 GTP, CTP, UTP 주식 녹여참고: 37 ° C를 350 rpm 설정 thermomixer 필요한 경우 솔루션에 시 약을 해산 하기 위해 사용할 수 있습니다. 과열 하거나 시간의 연장된 기간에 대 한 시 약은 thermomixer에 떠나 마십시오. 15 mL 튜브에 순서 및 표 2에 지정 된 볼륨에 사용에 따라 각 에너지 솔루션 마스터 믹스 구성 요소를 추가 합니다. 각 구성 요소를 추가한 후 솔루션 소용돌이입니다. 이 에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10의 5 mL을 만들 것입니다. 에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10 200 μ aliquots 2 mL 튜브에 나눕니다. 플래시 동결 각 약 수 단계 2.12에서에서 수행 합니다. 즉시 사용까지-80 ° C 냉동 실에 배치 합니다. 아미노산 마스터 믹스 신선한 4x 아미노산 마스터 믹스를 준비, 각 아미노산 재고 RT에서 녹고 고 다음 얼음에 각각 배치 하 여 시작 합니다. 소용돌이 / 37 ° C 350 rpm에서 설정 하는 thermomixer를 사용 하 여 모든 아미노산 주식은 완전히 용 해 되도록.참고: 시스테인 완전히 분해 되지 않을 수 있습니다; 그것은 정지로 아미노산 마스터 믹스에 추가할 수 있습니다. 과열 하거나 시간의 연장된 기간에 대 한 시 약은 thermomixer에 떠나 마십시오. 15 mL 튜브에 적절 한 볼륨 아미노산을 추가 살 균 디 물 각각의 최종 농도 다음 순서에 따라 8 mM: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, 그의 IIE, 리스, 메트로, 페, 프로, 백 산, 목, 발, TRP, TYR 레이, 그리고 CYS. 각 아미노산을 추가한 후 소용돌이 마스터 솔루션을 혼합. 표 2 에 나열 된 볼륨 아미노산 마스터 믹스의 2.4 mL를 만들 것입니다. 4 아미노산 마스터 믹스 x 2 mL 튜브에 200 μ aliquots 나눕니다. 플래시 동결 각 약 수 단계 2.12에서에서 수행 합니다. 즉시 사용까지-80 ° C에서 냉동 실에 넣으십시오. 반응 준비 플라스 미드 DNA 템플렛의 생산참고: 이 시스템에서 셀 무료 단백질 표정은 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (GFP) 식 벡터 T7-pJL1-sfGFP (테이블의 재료)를 사용 하 여 최적화 되었습니다. 셀 무료 반응 효율성과 복제 및 다른 단백질 시퀀스의 표현에 대 한 pJL1 백본 컨트롤로이 플라스 미드를 사용 하는 것이 좋습니다. 다른 플라스 미드 DNA 템플릿은 사용할 수 있습니다; 그러나, 그것은 중요 전사 T7 발기인 순서 및 T7 RNA 중 합 효소의 존재에 의해 제어 됩니다. 어떤 플라스 미드 DNA 템플렛 변형된 대장균 에서 대규모 생산에 대 한 간단한 프로토콜은 아래 설명 되어 있습니다. 제조 업체의 지시 (자료 테이블)에 의하여 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 원하는 벡터를 정화.참고: 가능한 플라스 미드 DNA 템플렛을 집중 셀 무료 반응의 꽉 볼륨 제약에 맞게 것이 좋습니다. 일반적으로, 750−1500 ng/μ 일 재고에 대 한 목표. 반응 준비 mRNA 서식 파일의 생산참고: 이 섹션은 선택 사항입니다. 단백질 표정 mRNA 템플릿이 나열된 T7 RNA 중 합 효소 (자료 테이블)에 의해 플라스 미드 T7-pJL1-sfGFP의 생체 외 녹음에서 생성 된 사용 하 여 테스트 되었습니다. 플라스 미드 표 3에서 생체 외 녹음 방송 반응 구성 요소를 사용 하 여 관심사의 단백질을 암호화 하는 DNA에서에서 mRNA 템플릿을 준비 합니다. 품 어는 thermocycler에서 37 ° C에서 1 시간에 대 한 반응.참고: 충분 한 자료를 생성 하는 동시에 이러한 반응의 8−10x를 수행 하는 것이 좋습니다. 모든 녹음 방송 반응 풀. 제조 업체의 지시 (자료 테이블)에 의하여 mRNA 정화와 집중 장치 키트를 사용 하 여 정화. 살 균 디 물으로 mRNA 템플릿을 elute. 사용까지-80 ° C에서 mRNA 서식 파일을 저장 합니다. 4. 수행 셀 무료 단백질 Eexpression 반응 사용 하 여 natriegens 대 원유 추출 플라스 미드 또는 선형 DNA 템플렛을 사용 하 여 셀 무료 단백질 표정 -80 ° C 냉동 고에서 에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10 및 아미노산 마스터 믹스 aliquots x 4 제거 RT에서 해 동 하 고 얼음에. -20 ° C 냉동 고에서 T7 RNA 중 합 효소, RNase 억제제 주식을 제거 하 고 얼음에. DNA 템플렛 RT와 얼음에 녹여 얼음에 2 mL 튜브에 다음과 같은 순서로 각 구성 요소를 추가 하 여 표 4 에 의하여 셀 무료 반응 마스터 믹스를 준비: 아미노산 마스터 믹스, 에너지 솔루션 마스터 믹스, Mg-조미료, K-조미료, DNA, 페그-8000, T7 RNA 중 합 효소, 템플릿과 RNase 억제제입니다. 부드럽게 마스터 믹스에 각 추가 후에 튜브를 터치 합니다.참고: 선형 서식 파일 셀 무료 단백질 식에 사용할 경우 단백질의 플라스 미드를 감지할 서식 파일에 비해 더 많은 자료를 생성 하는 5−10x를 추가 합니다. Natriegens 대 원유 세포 lysate 10−20 분 해 동 때까지 준비 단계-80 ° C 냉동 고 및 장소에서 2.12 얼음에에서 제거 합니다. 적절 한 볼륨 원유 셀 표 4 에 의하여 셀 무료 반응 마스터 혼합 추출 하 고 부드럽게 flicking 또는 아래로 pipetting 믹스를 추가 합니다. Thermocycler를 사용 하 여 끝점 셀 무료 단백질 표정 10 μ 96 또는 384 잘 PCR 접시의 바닥에 셀 무료 반응 마스터 믹스의 플라스틱 사이 PCR 접시에 각 전송 튜브를 부드럽게 터치 하 여 마스터 믹스 믹스.참고: 셀 무료 반응 마스터 혼합 반응 재현성 및 모든 샘플에 단백질 세포 자유로운 표현의 극대화를 항상 잘 혼합 한다. 짧게 1000 x g 10에서 격판덮개 원심 우물의 측에 갇혀 될 수 있습니다 어떤 마스터 믹스 수영장 s. 증발을 방지 하 고 다음 PCR 플레이트 thermocycler 105 ° c.에서 설정 온수 뚜껑 26 ° C에서 설정에 접시 접착제로 우물을 봉인참고: 열 배급 조차와 thermocycler의 온수 뚜껑 크게 단백질 식 수율을 향상 시킵니다. 3 h의 최소 셀 무료 반응을 품 어. 부 화, 후 표현한 단백질 정화, 계량, 고 다운스트림 프로세스에 대 한 사용.참고: 표현한 단백질 사용자의 선택의 방법을 사용 하 여 셀 무료 반응에서 직접 측정할 수 있습니다. 예를 들어 외부 표준 곡선을 사용 하 여 형광 단백질을 측정할 수 있습니다 또는 셀 무료 반응에 방사선된 아미노산을 사용 하는 경우 방사능 측정 될 수 있다. 자외선 보이는 분광학 또는 총 단백질 분석 실험은 일반적으로 권장 되지 않습니다 직접 초기 정화 없이 셀 무료 반응에서 단백질 생산을 측정. 또는, 플레이트 리더를 사용 하 여 셀 무료 단백질 식 활동을 모니터링 합니다. 투명 유리 바닥으로 검은 384-잘 분석 결과 접시의 바닥에 셀 무료 반응 마스터 믹스의 10 μ 플라스틱 얼음에 분석 결과 접시를 유지 또는 전체 운동 프로 파일을 얻을 수 있도록 마스터 믹스를 추가 하는 동안 추운 방에 작동. 증발을 방지 하 고 다음 시험 접시 26 ° c.에 설정 플레이트 리더를 분명 플레이트 접착제로 우물을 봉인 표현한 단백질에 해당 하는 적절 한 형광 여기/방출 파장을 모니터링 하는 동안 h 3−6에 대 한 셀 무료 반응을 품 어. 예를 들어 모니터에 전 / Em 485 nm/528 nm sfGFP에 대 한 =. MRNA의 서식 파일을 사용 하 여 셀 무료 단백질 표정 해 동 mRNA 템플릿 단계 3.5.2 RT와 얼음에 장소에서에서 준비. 수행 단계 4.1.1 4.1.6 이전에 지정 된 선형 또는 표 4 를 사용 하 여 mRNA 서식 파일에 대 한 대체 셀 무료 반응 마스터 믹스를 준비 하는 플라스 미드 DNA 템플렛. 5. sfGFP와 natriegens V. 셀-무료 반응의 교정 참고: 이 섹션은 선택 사항입니다. 최적의 셀 무료 반응 이온 농도 세포 세포의 용 해에 대 한 사용 조건에 따라 각 원유 추출 준비를 위해 약간 달라질 수 있습니다. 옵션 셀 무료 반응 이온 교정 프로토콜 반응 수율은 예상 보다 훨씬 낮은 경우에 sfGFP를 사용 하 여 아래 설명 된 (농도 < 1.0 μ g/mL)를 수행 하십시오. Mg2 + 및 멸 균 디 물 100 mM Mg 조미료 및 2000 m m에서 표 5 에 지정 된 대로 K+ 이온 보정 솔루션 단계 3.1.1에서 K-조미료 주식 준비. 필요할 때까지 얼음에 교정 솔루션을 배치 합니다. 표 6에서 교정 지도 따라 384-잘 PCR 접시에 적절 한 우물에 Mg-조미료의 1 μ와 K-조미료 이온 보정 솔루션의 2 μ 플라스틱. 이 단계의 작업 순서는 다음과 같습니다: 피펫으로 Mg-조미료 이온 보정 솔루션 각각의 하단에 잘 이어서 잘의 측에 K-조미료 이온 보정 솔루션 우물에 이미 있는 액체를 건드리지 않고. 교정 셀 무료 반응 마스터 믹스를 준비 하는 동안 증발을 방지 하기 위해 플레이트 위에 접착제를 배치 하 여 우물을 봉인. 부드럽게 혼합 Mg과 K 조미료 교정 솔루션 384-잘 접시를 누릅니다.참고: 리피터 피 펫이 reproducibly 하 고 신속 하 게이 단계를 완료에 대 한 좋습니다. 표 5 2 mL 튜브에 T7-pJL1-sfGFP 플라스 미드 DNA 템플렛을 사용 하 여 지정 된 대로 보정 셀 무료 반응 마스터 믹스를 준비 합니다. 믹스 마스터를 다음과 같은 순서로 각 구성 요소를 추가: 아미노산 마스터 믹스, 에너지 솔루션 마스터 믹스, T7-pJL1-sfGFP DNA 템플렛, 페그-8000, T7 RNA 중 합 효소, 그리고 RNase 억제제. 부드럽게 터치 하는 각 구성 요소 추가 후 혼합 튜브.참고: Mg을 추가 하지 마십시오2 + 또는 K+ 를 보정 셀 프리 믹스 마스터. 접시에서 접착제를 제거 합니다. 신중 하 게 우물에 이미 있는 혼합된 이온 보정 솔루션을 건드리지 않고 우물의 측면에 교정 셀 무료 반응 마스터 믹스의 7 μ 플라스틱. 접착제와 우물을 봉인 하 고 부드럽게 이온 보정 솔루션 마스터 셀 프리 믹스를 섞어 384-잘 PCR 접시를 누릅니다.참고: 리피터 피 펫이 reproducibly 하 고 신속 하 게이 단계를 완료에 대 한 좋습니다. 짧게 원심 판 1000 x g 10에 대 한 s 우물의 측에 갇혀 될 수 있습니다 어떤 순수한 액체 수영장. 105 ° c.에서 설정 온수 뚜껑 26 ° C에서 설정 thermocycler 384-잘 접시를 넣습니다 3 h에 대 한 셀 무료 반응을 품 어. 부 화, 후 각의 내용을 멀티 채널 피 펫으로 유리 바닥으로 검은 384-잘 시험 접시에 전송과 읽기에서 sfGFP의 형광 전 / Em = 485 nm/528 nm 플레이트 리더를 사용 하 여 이온 농도 조합을 결정 하는 단백질의 높은 금액을 생성합니다.