JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

תא ללא חלבון ביטוי באמצעות החיידק גדל במהירות ויבריו natriegens

Published: March 14, 2019
doi:
10.3791/59495
, , ,
1Department of Genetics,Harvard Medical School, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering

Summary

מערכות ללא תא ביטוי הן כלי עוצמתי וחסכוני עבור תפוקה גבוהה סינתזה ו ההקרנה של חלבונים חשובים. כאן, אנו מתארים את הכנת המערכת ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות ויבריו natriegens לייצור חלבון המהירה באמצעות פלסמיד DNA DNA ליניארי, תבנית ה-mRNA.

Abstract

החיידק ימית ויבריו natriegens צברה תשומת לב רבה כמארח מיקרוביאלי המתעוררים לביוטכנולוגיה בשל קצב הצמיחה המהיר שלה. פרוטוקול כללית מתוארת עבור הכנת נ’ natriegens תא גולמי תמציות בעזרת ציוד מעבדה נפוץ. פרוטוקול זה מניב גבוהה כבר במיוחד מותאמת לנגישות המשתמש ואת עלות מופחתת. סינתזה של חלבון נטול תאים (CFPS) יכול להתבצע בתגובות בקנה מידה קטן 10 μL אצווה בתבנית או 96 – או 384-ובכן, reproducibly מניב ריכוזי > 260 μg/mL סופר תיקיה GFP (sfGFP) בתוך ה 3 בסך הכל, תא גולמי לחלץ והכנה CFPS יכולה להיות מושגת בימים מלא 1−2 על ידי משתמש בודד. פרוטוקול זה ניתן לשלב בקלות לתוך צינורות סינתזה של חלבון קיים כדי להקל על ההתקדמות ביו-הייצור ויישומים ביולוגיה סינתטית.

Introduction

סינתזה של חלבון נטול תא היא שיטה רב-תכליתי וחסכוני עבור הביטוי של חלבונים יקר או פפטידים1,2,3,4. מבחינה היסטורית, סינתזה של חלבון נטול תא בוצעה באמצעות מערכות ביטוי Escherichia coli ; עם זאת, היה נחשול האחרונות שימוש אלטרנטיבי, ללא-דגם אורגניזמים עם מאפיינים הרומן מארז עבור ביטוי נטולת תא5,6,–7,–8,–9 , 10 , 11 , 12. אורגניזם בעל פרופיל מטבולי ייחודי הם מועמדים כחלופות למערכות ללא תא החיידק . לדוגמה, החיידק ימית שויבריו natriegens הוא המהירות גוברת של כל האורגניזמים ידוע עם התצפיות הכפלת זמן של פחות מ- 10 דקות13. זה צברה נ’ natriegens תשומת לב רבה כמארח מיקרוביאלי המתעוררים ביוטכנולוגיה ומחקר14,15,16,17,18. בהתחשב בכך יש שיעור הצמיחה המהירה של נ’ natriegens מקושר שיעור גבוה של סינתזת חלבונים ויעילות מטבולית19,20,21, רתימת מכונות הסלולר שלה ללא תא סינתזה עשוי להרחיב באופן משמעותי ערכת הכלים עבור ייצור החלבון מהירה ו ההקרנה תפוקה גבוהה.

לאחרונה, תא-חינם נ’ natriegens ביטוי המערכת הוכח שהוא מסוגל לייצר תיקייה סופר GFP (sfGFP) בריכוזים של > 260 μg/מ ל-3 שעות עם יזם T79. המטרה הכוללת של פיתוח שיטה זו היה לספק למשתמשים מערכת ביטוי מאוד נגיש, חסכוניים, הדירים גבוהות תנובה ללא תא חלבון ניתן להכין בעזרת ציוד מעבדה נפוץ בתוך זמן קצר. פרוטוקול זה מנצל תרבויות 1 ליטר טלטול מבחנות, פירוק תאים על-ידי sonication הדופק, ותגובות אצווה בקנה מידה קטן בתבנית 96 – או 384-ובכן להגדיל את תפוקת parallelization וסינון. ביטוי חלבון ארוך, ממושך התאפשר על ידי תוספת של חומצה 3-phosphoglyceric (3-PGA) כמו אנרגיית מקור8,22,23. בסיום בהצלחה פרוטוקול זה, למשתמש יש את היכולת לבטא חלבון הרצוי או לחלץ קבוצת חלבונים בתבנית ללא תא באמצעות נ’ natriegens תא גולמי.

החל ממניה גליצרול, נ’ natriegens תא גולמי תמציות מוכנות מתאי נקצרו של צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של 1.0. תרבות 1 ליטר תניב כ 2−3 מ ל תמצית, וזה מספיק עבור יותר מ-800 תגובות ללא תא ב 25% תמצית תא גולמי. חלבונים יכול להתבטא באמצעות פלסמיד ה-DNA, ה-DNA ליניארי או תבנית ה-mRNA; עם זאת, השפלה תבנית ה-DNA ליניארי מאת nucleases אנדוגני נשאר חיסרון גדול בעת שימוש פראי סוג נ’ natriegens תא ללא מערכת9. החל מתרבויות נ’ natriegens , חלבון שמיש עבור יישומי הזרם יכולה להיות מושגת על ידי משתמש בודד בימים מלא 1−2.

Protocol

1. הכנת נ’ natriegens גולמי תא תמציות – התרבות חיידקי להכין נ’ natriegens התפתחות חיידקים מדיה LB-V2 לפי טבלה 1. לחטא את המדיה הצמיחה על ידי autoclaving. לאפשר מדיה להגיע לטמפרטורת החדר (RT). לאחסן מדיה עודף-RT.התראה: תלבש ציוד למיגון אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי) ולהתייעץ מעבדה הוראות ספציפיות כאשר פועל החיטוי. השתמש גליצרול מסוג בר נ’ natriegens כדי לחסן 3 מ”ל של מדיה LB-V2. לגדול בין לילה ב 30 מעלות צלזיוס תוך טלטול-225 סל ד. רוחצים 1 מ”ל של התרבות לילה על ידי צנטריפוגה ב x 10,600 g בצנטריפוגה benchtop עבור 1 מינימלית לשאוב תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר וכתוצאה מכך את resuspend ב 1 מ”ל של מדיה LB-V2 טריים. ב L 4 בלוק במבוכה Erlenmeyer הבקבוק עם כיסוי סטרילי, להוסיף 1 ליטר של מדיה צמיחה LB-V2 טריים. לחסן באמצעות 1 מ”ל של תרבות לילה שטוף (1:1, 000 יחס דילול). לגדול תרבות ב 30 מעלות צלזיוס תוך טלטול-225 סל ד.הערה: (פ’) natriegens תרבויות וניתן לשנותם למעלה או למטה תוך שמירה על יחס דילול 1:1,000. לדוגמה, להוסיף 250 μL של תרבות לילה שטף של 250 מ של התקשורת צמיחה LB-V2 טריים 2 L התפישה Erlenmeyer הבקבוק עם כיסוי סטרילי. המוניטור של התרבות יתר600 באמצעות ספקטרופוטומטרים- כאשר תרבות מגיע ל- OD600 = 1.0 ± 0.2, תרבות הקציר באמצעות צנטריפוגה ב x 3,500 g למשך 20 דקות ב 4 º C. במקום גלולה על קרח.הערה: (פ’) natriegens גדל במהירות, ולכן נחוץ מעקב צמוד של התרבות. צמיחה OD600 = 1.0 צריך לקחת כ 1.5−2 h-יחס דילול 1:1,000. וארוקן את תגובת שיקוע מיד ואחסון בגדר חיידקי תוצאות ב-80 מעלות צלזיוס או להמשיך ישירות לתא פירוק המתוארות בסעיף 2.הערה: שלב זה מהווה נקודת עצירה טובה; עם זאת, מומלץ כי בגדר יעובדו באופן מיידי או תוך ימים 1−2 לקבלת התוצאות הטובות ביותר. 2. הכנת נ’ natriegens גולמי תא תמציות – פירוק התא להכין S30 מאגר פירוק לפי טבלה 1 במים סטריליים יונים (DI), להתאים את ה-pH ל 7.7 באמצעות חומצה אצטית.התראה: חומצה אצטית כדאי לבצען באמצעות עיקרון השוויון הפוליטי הנכון בעת כוונון רמת ה-pH. מאגר מגניב של פירוק S30 עד כ 4 ° C במקרר או על קרח לפני תחילת הליך פירוק התא.הערה: תמורת מהירה למטה, פירוק מאגר ניתן להניח ב-20 ° C. אל תאפשר את המאגר להקפיא. במקום כדורי תא על הקרח 10−20 דקות או עד הקרת לחלוטין. Resuspend כדורי כל הנובע התרבות 1 ליטר אותו באמצעות 10 מ”ל קר S30 פירוק המאגר ולאחר מכן להעביר את ההשעיה שפופרת 50 מ. אם כדורי שאינן מוקפאות במקפיא ב-80 מעלות צלזיוס בשלב 1.6, להמשיך ישירות resuspension.הערה: להגביר את עוצמת הקול של מאגר פירוק S30 נהגו בתחילה resuspend כדורי כנדרש. צנטריפוגה ההשעיה ב x 3,500 g 10 דקות ב 4 º C. וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. לשטוף את צניפה בפעם השנייה באמצעות 10 מ”ל קר S30 פירוק המאגר. במקום גלולה על קרח. בחדר קר, להוסיף 500 μL קר S30 פירוק מאגר בגדר לשפופרת 50 מ. באמצעות טיפ רחב נשא פיפטה, resuspend בגדר ולהעביר בזהירות את המתלים גלולה שלמה צינור 2 מ”ל.הערה: אם רחב נשא פיפטה אינה זמינה, השימוש זוג מספריים לחתוך בסוף טיפ פיפטה 1 מ”ל להגדיל נשא להעברת גלולה. להעביר גלולה רב ככל האפשר מבלי להגדיל באופן משמעותי את עוצמת הקול; עם זאת, בגדר צריך להיות resuspended בנוזל מספיק כדי להיות sonicated, כפי שמציין השעיה הומוגנית בצינור 2 מ”ל. אל תמלא יותר מדי את הצינור 2 מ”ל. המתלה לא יעלה על 1.5 מ; פצל צינורות מרובים במידת הצורך. לשמור בגדר תא בקרח ולעבוד בחדר קר. מילוי גביע 600 מ עם קרח והצב בעל צינור 2 מ”ל על-גבי הקרח.הערה: היא מסייעת למקם בעל שפופרת ליד הצד של הספל, אז ההשעיה צניפה יהיה גלוי בתוך הקרח כדי לעקוב אחר ההתקדמות sonication (ראה איור 1). מערבולת מושעה צניפה בצינור 2 mL לזמן קצר כדי homogenize את התאים, לפתוח את צינורות קפיצי כדי להסיר תאים על החלק התחתון של המכסה, מקום לתוך צינור מחזיק עם כובע. עצה sonicator התחתון לתוך המתלה כך הוא רק מתחת לפני השטח נוזלי. הכינו את הסידור sonication כפי שהיא מתוארת באיור 2 באמצעות sonicator המקדח בקוטר עצה ⅛ אינץ. קלט את ההגדרות הבאות לתוך הפקד sonicator: 20 קילוהרץ תדירות והמרביים 50%, דופק בזמן: 10 s, זמן מחוץ דופק: 60 s. להפעיל את פרוטוקול sonication הדופק שלושה מחזורים. אם הנפח הכולל של המתלה צניפה > 500 μL, להפעיל את פרוטוקול sonication הדופק שש פעמים.הערה: באופן כללי, 3−6 פולסים מספיקים lyse נ’ natriegens כדורי; פולסים נוספים העשויים להידרש, בהתאם sonicator. במהלך sonication, להשתמש פלטפורמת כפתור התאמה כדי להזיז את החללית למעלה ולמטה כדי lyse כל גלולה כי ייתכן התיישבו לתחתית הצינור. ניתן להסיר את הצינור מן מחזיק בקצרה vortexed כדי homogenize מחדש את המתלים בין פולסים. ראה דיון להלן לקבלת המרקם הרצוי של תאים sonicated.התראה: להשתמש באמצעי מניעה שמיעה המתאימים sonicator פעילה. בעקבות sonication, תא גולמי צנטריפוגה לחלץ ב x 16,000 g למשך דקות 30−45 ב 4 ° C, או עד lysate הינה ללא כל פסולת הסלולר כפי שהיא מתוארת באיור 3. בחדר קר, aliquot 50 μL של supernatants שנוצר כדי צינורות 2 mL החדש מבלי להפריע בגדר.הערה: נפולת המועבר בטעות לתוך הצינורות 2 mL החדש יהיה להפחית באופן דרסטי קיבולת של תמצית גבוהה מניב סינתזה של חלבון. באופן אופציונלי, מניחים בצד μL 10 של תא לחלץ על כימות שלאחר פירוק החלבון ב- mL 2 נפרדים צינור (ראה שלב 2.13 להלן). פלאש להקפיא תמציות תא גולמי על ידי הנחת צינורות לתוך בעל שפופרת עם מחרוזת וטבלו מחובר כפי שהיא מתוארת באיור 4. להטביע צינורות לתוך דיואר המכילה חנקן נוזלי ומניחים מיד במקפיא ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.התראה: השתמש עיקרון השוויון הפוליטי המתאים לטיפול בחנקן נוזלי כולל חלוק המעבדה, בטיחות משקפיים, מגן פנים, cryogen סינר כפפות. באופן אופציונלי, לכמת את החלבון הכולל של התא lysate באמצעות μL 10 קבע מלבד שלב 2.11.1 על ידי דילול מדגם מטריים 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) באמצעות כל assay כימות חלבון הכולל סטנדרטיים כגון ברדפורד assay, חומצה bicinchoninic assay (BCA), וכו ‘. 3. הכנת מרכיבי התא ללא תגובה רכיבי התגובה הכללית להכין עבודה מניות של Mg-גלוטמט ו K-גלוטמט 50 מ ל צינורות מים סטריליים DI בריכוזים של 100 מ מ, 2000 מ מ, בהתאמה. להכין מלאי עבודה של 50% (w/v) פוליאתילן גליקול (PEG)-8000 על-ידי הוספת 100 מ של די סטרילי מים גביע 250 מ. המקום פגים קטנים לתוך הספל. שוקל את 50 גרם של פג-8000 ולהוסיף 100 מ של מים במיכל. מקם את הספל על סט צלחת מחוממת מערבבים עד 100 ° C ומערבבים -250 סל”ד עד פג-8000 נמצא פתרון. לאפשר פג-8000 נוזל התערובת להתקרר לפני העברת צינורות 50 מ. אנרגיה פתרון מיקס מאסטר להכין פתרון 5 מ’ של קו על-ידי הוספת 140 גר’ כדורי קו 500 מ”ל מים DI סטרילי.התראה: להכין פתרון זה בשכונה כימי וללבוש עיקרון השוויון הפוליטי בעת טיפול בסיסים חזקים. הפתרון יהיה חם אז הפקק חייב להיות חופשי כדי למנוע הצטברות הלחץ. לאפשר את הפתרון KOH להגיע RT לפני השימוש. להכין מאגר HEPES-קו מ מ 1750 על ידי הוספת 20.85 גר’ HEPES בקבוק 100 מ. לאט לאט מוסיפים מים DI סטרילי עד האחסון מגיע 40 מ. מערבולת בבקבוק כדי להמיס את HEPES. השתמש הפתרון קו 5 מ’ כדי להתאים את ה-pH ל 8.0 ולהביא פתרון האחסון עד 50 מ”ל.התראה: KOH כדאי לבצען באמצעות עיקרון השוויון הפוליטי הנכון בעת כוונון רמת ה-pH. להכין את 10 הנותרים x אנרגיה מיקס מאסטר רכיבים מניות בריכוזים המצוין בטבלה 2 במים DI סטרילי ומניחים כל מניה על קרח. הפשרת 100 מ מ ATP, GTP, CTP, זוג שזור המניות RT ובמקום על קרח.הערה: Thermomixer מוגדר כ- 37 ° C ו 350 סל”ד ניתן לפזר את ריאגנטים פתרון במידת הצורך. אין התחממות יתר או להשאיר ריאגנטים thermomixer לתקופה ממושכת של זמן. בשפופרת 15 מ”ל, הוסף רכיב מיקס מאסטר כל אנרגיה פתרון בהתאם ההזמנה ואת אמצעי האחסון שצויין בטבלה מס ‘ 2. מערבולת הפתרון לאחר כל רכיב נוסף. פעולה זו תגרום 5 מיליליטר 10 x אנרגיה פתרון מיקס מאסטר. לחלק את 10 x אנרגיה פתרון מיקס מאסטר aliquots μL 200 מ ל 2 צינורות. פלאש להקפיא כל aliquot כפי שבוצע בשלב 2.12. מיד למקם אותם לתוך המקפיא-80 ° C עד השימוש. חומצת אמינו מיקס מאסטר כדי להכין טרי 4 x מיקס מאסטר חומצת אמינו, להתחיל מפשיר כל מניה חומצת אמינו ב RT ולאחר מכן מציבים אחד על קרח. השתמש המערבולת ו/או thermomixer שוכן בגובה 37 ° C ו 350 סל”ד כדי להבטיח שכל חומצת אמינו מניות הם להתמוססות מלאה.הערה: ציסטאין יכול לחלוטין אינם מתמוססים; זה ניתן להוסיף לתערובת בסיס חומצת אמינו כמו השעיה. אין התחממות יתר או להשאיר ריאגנטים thermomixer לתקופה ממושכת של זמן. בשפופרת 15 מ”ל, להוסיף חומצות האמינו את אמצעי האחסון המתאים DI במים סטריליים כך הריכוז הסופי של כל אחד הוא 8 מ מ לפי הסדר הבא: ALA ARG, ASN, ASP, אך זה לא נגמר, GLU, GLY, שלו, שקר, ליס, MET, PHE, PRO, SER, חמישי, וואל, TRP, טיר , LEU, ואת CYS. לאחר הוספת כל חומצת אמינו, מערבולת הבסיס מערבבים פתרון. אמצעי האחסון המפורטים בטבלה מס ‘ 2 יפצה 2.4 מ ל חומצה אמינית מיקס מאסטר. לחלק את 4 x מיקס מאסטר חומצת אמינו aliquots μL 200 מ ל 2 צינורות. פלאש להקפיא כל aliquot כפי שבוצע בשלב 2.12. מניחים מיד בפריזר ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש. הפקה של תבנית ה-DNA פלסמיד מוכן-תגובההערה: ביטוי חלבון נטול תאים במערכת זו מוטבה באמצעות הווקטור ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) התיקיה סופר T7-pJL1-sfGFP (טבלה של חומרים). מומלץ להשתמש הזה פלסמיד כפקד התגובה ללא תא וב עמוד השדרה pJL1 שיבוט וביטוי של רצפי חלבונים אחרים. ניתן להשתמש בתבניות דנ א פלסמיד אחרים; עם זאת, חשוב לציין כי שעתוק נשלטת על ידי רצף יזם T7 ואת נוכחותם של T7 RNA פולימראז. פרוטוקול פשוט לייצור בקנה מידה גדול של כל תבנית ה-DNA פלסמיד של טרנספורמציה e. coli המתואר להלן. לטהר וקטור הרצוי באמצעות ערכת טיהור פלסמיד לפי הוראות היצרן (טבלה של חומרים).הערה: ריכוז את תבנית ה-DNA פלסמיד ככל האפשר מומלץ להכיר את האילוצים נפח צר של התגובה ללא תא. באופן כללי, המטרה עבור מלאי עבודה ng/μL 750−1500. הפקה של תבנית ה-mRNA מוכן-תגובההערה: סעיף זה הוא אופציונלי. ביטוי חלבון נבדקו באמצעות תבנית ה-mRNA של שעתוק במבחנה של פלסמיד T7-pJL1-sfGFP שיוצר את הרשומים T7 RNA פולימראז (טבלה של חומרים). מכינים תבנית ה-mRNA של פלסמיד DNA קידוד החלבון עניין באמצעות רכיבי התגובה של שעתוק במבחנה בטבלה3. דגירה תגובות עבור h 1-37 מעלות צלזיוס thermocycler.הערה: מומלץ לבצע 8−10x של תגובות אלו במקביל כדי לייצר מספיק חומר. מאגר כל התגובות שעתוק. לטהר באמצעות ערכת טיהור, רכז של mRNA לפי הוראות היצרן (טבלה של חומרים). Elute תבנית ה-mRNA למים DI סטרילי. לאחסן תבנית ה-mRNA ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש. 4. ביצוע ללא תא Eexpression חלבון באמצעות תגובות נ’ natriegens גולמי לחלץ ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות פלסמיד או תבנית ה-DNA ליניארי להסיר 10 x אנרגיה פתרון מיקס מאסטר 4 x חומצת אמינו מיקס מאסטר aliquots מן המקפיא-80 ° C, להפשיר ב RT, ומניחים על קרח. הסר את T7 RNA פולימראז ואת RNase מעכב מניות במקפיא-20 ° C ומניחים על קרח. להפשיר את תבנית ה-DNA RT ובמקום על קרח. להכין תערובת התגובה ללא תא אב לפי טבלה 4 על-ידי הוספת כל רכיב לפי הסדר הבא צינור 2 מ”ל על הקרח: מיקס מאסטר חומצת אמינו, אנרגיה פתרון מיקס מאסטר, Mg-גלוטמט, K-גלוטמט, תבנית ה-DNA, פג-8000, T7 RNA פולימראז ו RNase מעכבי. קפיצי בעדינות את הצינור לאחר כל הוספה לתערובת הראשית.הערה: אם תבנית קווית היא להשתמש להבעה חלבון נטול תאים, להוסיף 5−10x עוד חומר לעומת פלסמיד תבנית כדי להשיג ניכר התשואות של חלבון. הסר נ’ natriegens גולמי תא lysate מוכנים בשלב 2.12-80 ° C מקפיאים, המקום על הקרח 10−20 דקות עד הקרת. הוסף את אמצעי האחסון המתאים תא גולמי לחלץ לתערובת אב התא ללא תגובה לפי טבלה 4 ומערבבים בעדינות על-ידי מצליף או pipetting למעלה ולמטה. ביטוי חלבון נטול תא מובילים באמצעות thermocycler פיפטה 10 μL של המיקס אב התא ללא תגובה בתחתית צלחת PCR 96 – או 384-ובכן. בין כל העברה לבסיס PCR, מערבבים את תערובת הבסיס על ידי מצליף את הצינור בעדינות.הערה: מיקס מאסטר ללא תא התגובה צריכה להיות מעורב טוב בכל עת כדי למקסם את התגובה הפארמצבטית וביטוי חלבונים ללא תא כל הדגימות. Centrifuge בקצרה את הצלחת ב x 1000 g 10 s אספנו את כל תערובת בסיס עשוי להיות תקועה בצידי הבארות. חותם הבארות עם דבק צלחת כדי למנוע אידוי, ואז למקם את הצלחת ה-PCR thermocycler להגדיר בטמפרטורה 26 ° C עם מכסה מחוממת שוכן בגובה 105 ° C.הערה: אפילו חום הפצה של המכסה מחוממת של thermocycler משפר באופן משמעותי את התשואות ביטוי חלבון. דגירה התגובות תא ללא מינימום של 3 שעות. לאחר דגירה, ביטוי חלבונים יכולים להיות מטוהרים, לכמת, המשמש עבור תהליכים במורד הזרם.הערה: ביטוי החלבונים ניתן לכמת ישירות בהתגובה ללא תא באמצעות שיטה לבחירה של המשתמש. לדוגמה, חלבונים פלורסנט ניתן לכמת באמצעות מעגל חיצוני רגיל או ניתן למדוד קרינה רדיואקטיבית אם משתמש של חומצת אמינו radiolabeled התגובה ללא תא. ספקטרוסקופיה UV-גלוי או חלבון הכולל מבחני הם בדרך כלל לא מומלץ למדידת ייצור החלבון בתגובות נטול תאים ללא טיהור ראשוני ישירות. לחלופין, לפקח קינטיקה ביטוי חלבון תא ללא שימוש בקורא צלחת. פיפטה 10 μL של המיקס אב התא ללא תגובה בתחתית צלחת assay 384-ובכן שחור עם תחתית זכוכית שקופה. לשמור על הלוחית assay קרח או לעבוד בחדר קר תוך הוספת המיקס מאסטר כדי להבטיח כי הפרופיל קינטי מלא מתקבל. חותם הבארות עם דבק צלחת ברורה כדי למנוע אידוי ולאחר מכן מקם את הצלחת assay לקורא את הצלחת להגדיר בטמפרטורה 26 ° c דגירה התגובות נטול תאים עבור 3−6 h תוך מעקב אחר פלורסנט המתאימים עירור/פליטה אורכי הגל המתאים החלבון ביטוי. לדוגמה, לפקח על Ex / Em = 485 nm nm/528 עבור sfGFP. ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות תבנית ה-mRNA הפשרה mRNA תבנית מוכנה בשלב 3.5.2 RT ובמקום על קרח. בצע את שלב 4.1.1 דרך שלב 4.1.6 כאמור שצוינו עבור ליניארי או תבנית ה-DNA פלסמיד באמצעות טבלה 4 להכין תערובת בסיס התגובה ללא תא חלופי עבור תבנית ה-mRNA. 5. כיול נ’ natriegens תא ללא תגובות עם sfGFP הערה: סעיף זה הוא אופציונלי. ריכוז יון התגובה האופטימלית ללא תא יכול להשתנות מעט עבור כל הכנת תמצית גולמי בהתאם לתנאים המשמש עבור פירוק התא. שקול ביצוע התגובה ללא תאים אופציונלית יון כיול הפרוטוקול המתואר להלן באמצעות sfGFP אם התגובה תשואות נמוכות משמעותית מהצפוי (ריכוזים < 1.0 μg/mL). להכין Mg2 + K+ יון כיול פתרונות כמפורט בטבלה 5 במים DI סטרילי 100 מ מ Mg-גלוטמט, מ מ 2,000 מניות K-גלוטמט מוכן בשלב 3.1.1. במקום פתרונות כיול על הקרח עד שהוא נדרש. בעקבות המפה כיול טבלה 6, pipette 1 μL של Mg-גלוטמט ו- 2 μL של K-גלוטמט יון כיול פתרונות לתוך הבארות המתאים בצלחת PCR 384-. טוב. סדר פעולות של שלב זה הוא כדלקמן: פיפטה Mg-גלוטמט יון כיול פתרון לתוך החלק התחתון של כל טוב ואחריו הפתרון כיול יון K-גלוטמט לצד הבאר בלי לגעת הנוזל כבר נוכח הבארות. חותם את הבארות על-ידי הצבת דבק על גבי הלוח כדי למנוע אידוי בעת הכנת המיקס מאסטר של תגובת התא ללא כיול. טפח בעדינות את הצלחת 384-טוב לערבב את הפתרונות כיול מ ג – ו K-גלוטמט.הערה: פיפטה ממסר מומלץ מאוד להשלמת שלב זה reproducibly ובמהירות. הכנת כיול תגובת התא ללא בסיס המיקס כמפורט בטבלה 5 באמצעות תבנית ה-DNA פלסמיד T7-pJL1-sfGFP בשפופרת 2 מ”ל. להוסיף כל רכיב לפי הסדר הבא לתערובת בסיס: מיקס מאסטר חומצת אמינו, אנרגיה פתרון מיקס מאסטר, תבנית ה-DNA T7-pJL1-sfGFP, פג-8000, T7 RNA פולימראז ו RNase מעכב. קפיצי בעדינות את הצינור כדי לערבב לאחר כל הוספה רכיב.הערה: אל תוסיף Mg2 + או K+ כדי הכיול נטולת תא מיקס מאסטר. הסר את הדבק הצלחת. בזהירות פיפטה 7 μL של כיול התגובה ללא תא מיקס מאסטר על צדי הבארות בלי לגעת הפתרון כיול יון מעורב כבר נוכח הבארות. לאטום מחדש את הבארות עם הדבק והקש בעדינות את הצלחת ה-PCR 384-טוב לערבב את התמהיל ללא תא אב עם הפתרון כיול יון.הערה: פיפטה ממסר מומלץ מאוד להשלמת שלב זה reproducibly ובמהירות. בקצרה centrifuge 1,000 x צלחת g עבור 10 s אספנו את כל נוזל החלקיות עשוי להיות תקועה בצידי הבארות. למקם את הצלחת 384-ובכן thermocycler להגדיר בטמפרטורה 26 ° C עם מכסה מחוממת שוכן בגובה 105 ° C. דגירה לתגובות ללא תא במשך 3 שעות. לאחר דגירה, להעביר את התוכן של כל טוב צלחת assay 384-ובכן שחור עם תחתית זכוכית עם פיפטה רב ערוצית ולקרוא את זריחה של sfGFP-Ex / Em = 485 nm nm/528 שימוש בקורא צלחת כדי לקבוע את השילוב ריכוז יון זה התשואות הסכום הגבוה ביותר של חלבון.

Representative Results

פרוטוקול המתואר עבור ייצור החלבון נ’ natriegens תא ללא ביטוי במערכת יכולה להתבצע בימים 1−2 על ידי משתמש בודד, החל מחיסון של תרבות לחלבון זמין ליישומים במורד הזרם. הכנת תמציות תא גולמי, מיקס מאסטר המלאי מהווים חלק משמעותי של התקופה; עם זאת, ברגע מוכן, רוב בצובר ריאגנטים יכול להיות מאוחסנת לטווח ארוך (טבלה מס ‘ 7), להשתמש לפי הצורך, קיצור הזמן הדרושה להשלמת בפרוטוקול. מערכת ביטוי המתואר מומלץ להשתמש עם תבנית ה-DNA פלסמיד או mRNA שנוצר על ידי שעתוק במבחנה תגובות. בעוד DNA ליניארי יכול גם לשמש כתבנית לייצור חלבון, זה מניב סכום נמוך משמעותית של חלבון. לדוגמה, ב תנאים אופטימליים תגובות ב 26 °C, תגובה ללא תא μL 10 יחיד יכול לייצר > 260 μg/mL של sfGFP בעוד 3 שעות באמצעות pmol 0.3 של תבנית ה-DNA פלסמיד או דומות > 125 μg/mL של sfGFP באמצעות pmol 14 של mRNA תעתיק (איור 5A B). עם זאת, pmol 0.3 של DNA ליניארי יפיק באופן משמעותי פחות חלבון (< 20 μg/mL). עבור כל סוג תבנית, הרוב המכריע של החלבון יופק בתוך 1−1.5 h; עם זאת, מומלץ כי התגובה מנוהלת עבור שהייה של 3 שעות. תגובת התא ללא ריכוזים של sfGFP היו נחושים באמצעות רגרסיה ליניארית באמצעות עיקול רגיל sfGFP מטוהרים מדידת קרינה פלואורסצנטית-Ex / Em = 485 nm/528 ננומטר. התשואה של ייצור החלבון מושפע באופן משמעותי הריכוז של יוני אשלגן ומגנזיום (K+ ו- Mg2 +, בהתאמה). בתנאים אופטימליים, התברר כי אופטימלית Mg2 + ו K+ יון ריכוזים יהיה 3.5 מ מ 80 מ מ, בהתאמה (איור 6A, B). לחריגות ריכוז יון אופטימלית עלול לגרום קיבולת ירידה של המערכת ללא תא ביטוי לייצר חלבון עם תשואות ניכר. כיול נוסף עשוי להיות נחוץ אם התגובה תשואות נמוכות משמעותית מהמצופה. פרוטוקול אופציונלי לכיול יון המתוארת בסעיף 5. דבר זה מאפשר גמישות ב מפצה על השתנות תמצית תא גולמי שנצברו מ תא בודד פירוק הציוד והתנאים. איור 1: להציג מקרוב מחזיק כוס כימית, שפופרת על פלטפורמת sonication- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2: Sonication התקנת ציוד עבור הכנת תא גולמי לחלץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3: תצוגה של בגדר ואחרי sonication צנטריפוגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4: פלאש קפוא מטבל לאחסון תמצית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5: נציג תוצאות עבור נ’ natriegens סינתזת חלבונים תא ללא שימוש בסוגי בתבנית אחרת. (א) קצה וזמינותו של ייצור sfGFP באמצעות equimolar ריכוזי פלסמיד תבנית ה-DNA ליניארי (0.3 pmol), כמו גם הגדלת ריכוזים של תבנית ה-mRNA. SfGFP תא ללא הריכוז נקבע באמצעות עיקול רגיל של sfGFP מטוהרים נמדד ב- Ex / Em = 485 nm/528 nm אחרי 180 דקות של דגירה בטמפרטורה 26 ° C-תנאי ריאקציה אופטימליים 10 כרכים μL. (B) assay קינטי של ייצור sfGFP באמצעות equimolar ריכוזי פלסמיד תבנית ה-DNA ליניארי, כמו גם הגדלת ריכוזים של תבנית ה-mRNA. מדידות sfGFP נלקחו כל 3 דקות-Ex / EM = 485 nm/528 nm מעל 180 דקות של זמן הדגירה הכולל-תנאי ריאקציה אופטימליים 10 כרכים μL. עבור נקודת הקצה והן מבחני קינטי, הדגימות היו ריקים תוקנו באמצעות תגובות ללא תאים בתוספת כל הרכיבים למעט תבנית. מתכוונת סטיות תקן מוצגים (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 6: נציג תוצאות לכיול ריכוז יון. (א) נ’ natriegens תא ללא תגובות היו בתוספת הגדלת ריכוזים של Mg2 + , מודגרות בטמפרטורה 26 ° C ל 180 דקות בתגובות μL 10. ריכוז מוחלט של K+ היה 160 מ מ עבור כל מ ג2 + ריכוז. SfGFP תא ללא הריכוז נקבע באמצעות עיקול רגיל של sfGFP מטוהרים נמדד ב- Ex / Em = 485 nm/528 ננומטר. (B) נ’ natriegens תא ללא תגובות היו בתוספת הגדלת ריכוזים של K+ , מודגרות בטמפרטורה 26 ° C למשך 180 דקות בתגובות μL 10. ריכוז מוחלט של Mg2 + היה 3.5 מ מ עבור כל ריכוזי K+ . עבור שני ולידציות, דגימות היו ריקים תוקנו באמצעות תגובות ללא תאים בתוספת כל הרכיבים למעט תבנית. מתכוונת סטיות תקן מוצגים (n = 3). דמות זו שונתה Wiegand et al.9. הודפס מחדש באישור Wiegand, די. ג’יי, לי, הוד קדושתו, אוסטרוב, ש, הכנסייה, כללי של חטיבת הקמה של natriegens ללא תא ויבריו ביטוי המערכת. ביולוגיה ACS סינתטיים. 7 (10), 2475−2479 (2018). זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. טבלת אי הכנת LB-V2 התפתחות חיידקים מדיה רכיב כמות (g) ריכוז סופי (מ מ) נפח סופי (L) מרק ליברות (מילר) 25 1 NaCl 11.69 200 MgCl2 2.20 23.1 אשלגן כלורי 0.31 4.2 טבלה להיעשות הכנת מאגר פירוק S30A רכיב כמות (g) ריכוז סופי (מ מ) נפח סופי (L) טריס פתרון (pH 8.0) – 1 מ’ (mL) * 25 50 0.5 Mg-גלוטמט 2.72 14 K-גלוטמט 6.10 60 Dithiothreitol (DTT) – 1 מ’ (mL) * 1 2 טבלה 1: ריאגנטים עבור הכנת L 1 LB-V2 התפתחות חיידקים מדיה ו- 0.5 L מאגר פירוק תא S30A. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ ב- Excel.  הכנה של 10 x אנרגיה פתרון מיקס מאסטר רכיב ריכוז מניות (מ מ) ריכוז סופי (מ מ) כמות (µL) נפח סופי (µL) HEPES-KOH pH 8 1750 500 1428.57 5000 ATP 100 15 750.00 GTP 100 15 750.00 CTP 100 9 450.00 זוג שזור 100 9 450.00 tRNA של e. coli MRE 600 (mg/mL) * 100 2 100.00 מימה קואנזים A 200 2.6 65.00 NAD 200 3.3 82.50 מחנה 650 7.5 57.69 חומצה פולינית 100 0.7 35.00 Spermidine 1600 10 31.25 3-PGA 2000 300 750.00 סטרילי מים יונים 49.99 הכנת 4 x מיקס מאסטר חומצת אמינו רכיב ריכוז מניות (מ מ) ריכוז סופי (מ מ) כמות (µL) נפח סופי (µL) ALA 168 8 114.3 2400 ARG 168 8 114.3 ASN 168 8 114.3 ASP 168 8 114.3 אך זה לא נגמר 168 8 114.3 GLU 168 8 114.3 GLY 168 8 114.3 שלו 168 8 114.3 שקר 168 8 114.3 LYS 168 8 114.3 פגשתי 168 8 114.3 PHE 168 8 114.3 PRO 168 8 114.3 SER 168 8 114.3 חמישי 168 8 114.3 ואל 168 8 114.3 TRP 168 8 114.3 טיר 168 8 114.3 LEU 140 8 137.1 CYS 168 8 114.3 סטרילי מים יונים 91.4 טבלה 2: ריאגנטים עבור הכנת 5 מיליליטר 10 x אנרגיה פתרון מאסטר מיקס ו- 2.4 מ של 4 x מיקס מאסטר חומצת אמינו.    אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ ב- Excel. T7 RNA פולימראז בתגובות שעתוק חוץ גופית רכיב מניות (מ מ) ריכוז סופי (מ מ) תגובה 1 x כמות (µL) כמות (µL) 50 x תגובות 10 x RNAPol התגובה מאגר 1.00 50 ATP 100 0.5 0.10 5 GTP 100 0.5 0.10 5 CTP 100 0.5 0.10 5 זוג שזור 100 0.5 0.10 5 תבנית ה-DNA (ng/µL) * 1000 500 0.50 25 T7 RNA פולימראז 200 2.6 2.00 100 Rnase מעכב, מאתר 200 3.3 0.50 25 סטרילי מים יונים 15.60 780 עוצמת התגובה (µL): 20 טבלה 3: רכיבים שעתוק במבחנה לייצור mRNA.    אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ ב- Excel. מיקס מאסטר התגובה ללא תא רכיב ריכוז מניות (מ מ) ריכוז סופי (מ מ) תגובה 1 x כמות (µL) כמות (µL) 50 x תגובות תמצית (%) * 25 2.50 125.00 Mg-גלוטמט 100 3.5 0.35 17.50 K-גלוטמט 2000 80 0.40 20.00 4 x מיקס מאסטר חומצת אמינו 8.0 2 2.50 125.00 10 x אנרגיה פתרון מיקס מאסטר 1.00 50.00 פלסמיד ה-DNA (ng/µL) * 1000 500 0.50 25.00 50% פג-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00 T7 RNA פולימראז 1.00 50.00 RNase מעכב, מאתר 0.10 5.00 סטרילי מים יונים 1.25 62.50 עוצמת התגובה (µL): 10 חלופי ללא תא התגובה מאסטר Mix עבור תבנית ה-mRNA רכיב ריכוז מניות (מ מ) ריכוז סופי (מ מ) תגובה 1 x כמות (µL) כמות (µL) 50 x תגובות תמצית (%) * 25 2.50 125.00 Mg-גלוטמט 100 3.5 0.35 17.50 K-גלוטמט 2000 80 0.40 20.00 4 x מיקס מאסטר חומצת אמינו 8.0 2 2.50 125.00 10 x אנרגיה פתרון מיקס מאסטר 1.00 50.00 תבנית ה-mRNA (ng/µL) * 2000 4000 2.00 100.00 50% פג-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00 RNase מעכב, מאתר 0.10 5.00 סטרילי מים יונים 0.75 37.50 דולר ארה עוצמת התגובה (µL): 10 טבלה 4: רכיבים של אופטימיזציה נ’ natriegens תא ללא תגובת מיקס מאסטר עבור תבנית ה-DNA ו- mRNA תבנית.    אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ ב- Excel. מ ג 2 + כיול תגובה 1 x כמות (µL) תגובה 1 x כמות (µL) כמות (µL) 100 x תגובות כמות (µL) 100 x תגובות גמר (מ מ) מניות 100 מ מ Mg-Glu לשכפל 2 0 100 מ מ Mg-Glu H יונים2O 2.5 0 0.00 1.00 0 100 3.5 1 0.10 0.90 10 90 4.5 2 0.20 0.80 20 80 5.5 3 0.30 0.70 30 70 עוצמת התגובה (µL): 10 K + כיול תגובה 1 x כמות (µL) תגובה 1 x כמות (µL) כמות (µL) 100 x תגובות כמות (µL) 100 x תגובות גמר (מ מ) מניות 2000 מ מ K-Glu לשכפל 2 0 2000 מ מ K-Glu H יונים2O 40 30 0.15 1.85 12 148 80 70 0.35 1.65 28 132 160 150 0.75 1.25 60 100 320 310 1.55 0.45 124 36 עוצמת התגובה (µL): 10 מיקס מאסטר התגובה ללא תא של יון כיול רכיב ריכוז מניות (מ מ) ריכוז סופי (מ מ) תגובה 1 x כמות (µL) כמות (µL) 50 x תגובות תמצית (%) * 25 2.50 125.00 Mg-גלוטמט משתנה משתנה 1.00 50.00 K-גלוטמט משתנה משתנה 2.00 100.00 4 x מיקס מאסטר חומצת אמינו 8.0 2 2.50 125.00 10 x אנרגיה פתרון מיקס מאסטר 1.00 50.00 פלסמיד ה-DNA (ng/µL) * 1000 250 0.25 12.50 50% פג-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00 T7 RNA פולימראז 1.00 50.00 RNase מעכב, מאתר 0.10 5.00 סטרילי מים יונים 0.00 0.00 עוצמת התגובה (µL): 10 טבלה 5: ריכוז יון כיול mixes מאסטר.    אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ ב- Excel. יון CF כיול מפה 40 מ מ K+ 80 מ מ K+ 160 מ מ K+ 320 מ מ K+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2.5 מ מ Mg2 + A 3.5 מ מ Mg2 + B 4.5 מ מ Mg2 + C 5.5 מ מ Mg2 + D טבלה 6: יון כיול מפה.    אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ ב- Excel. תנאי אחסון, חיי המדף של רכיבים CF רכיב מיקום אחסון חיי מדף LB סטרילי-V2 צמיחה מדיה 4 ° C 3-6 חודשים (פ’) natriegens גולמי תא לחלץ -80 ° C 1-3 שבועות 100 מ מ Mg-גלוטמט חדר Temp 6 חודשים 2000 מ מ K-גלוטמט חדר Temp 6 חודשים 50% פג-8000 חדר Temp 6 חודשים 10 x אנרגיה פתרון מיקס מאסטר -80 ° C 3-6 חודשים 4 x מיקס מאסטר חומצת אמינו -80 ° C 3-6 חודשים תבנית ה-DNA פלסמיד/לינארי -20 ° C 6-12 חודשים mRNA תבנית -80 ° C 3-4 שבועות טבלה 7: תא ללא תנאי אחסון וחיי המדף.    אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ ב- Excel.

Discussion

פרוטוקול זה מוטבה פראי-סוג נ’ natriegens , התפתחות חיידקים מדיה מורכבת LB בתוספת מלחי V2 (טבלה של חומרים). זנים אחרים של נ’ natriegens יכול תרבותי דומה ליצירת תא גולמי תמציות לתגובות ללא תא; עם זאת, השימוש בהם דורש נוספים מיטוב של פרוטוקול זה. בנוסף, מערכת זו ביטוי חלבון נטול תא מוטבה באמצעות חומצה 3-phosphoglyceric (3-PGA) כמקור התחדשות האנרגיה העיקריים. מקורות אנרגיה אחרים של התחדשות עשוי לשמש; עם זאת, אופטימיזציה של ריאגנטים וכיול צפוי להיות נדרש כדי להשיג גבוהה מניב חלבון ביטוי10,11.

תשומת לב מסוימת מספר שלבים קריטיים של פרוטוקול זה יבטיח לפרודוקטיביות תמצית מקסימלי גבוהות תנובה נטולת תא ייצור החלבון. ראשית, חייבים להיות מוכנים תא גולמי תמצית מתרבויות נ’ natriegens תא האיסוף-שלב אמצע-מעריכית של צמיחה; חלבון התשואה הוא מקסימלי כאשר תרבויות מגיעים OD של600 = 1.0 ± 0.2. בזמן ייצור החלבון ללא תא אפשרית מתאי נקצרו מגוון של צפיפות אופטית, בעבר גילינו כי תאים שנקטפו במצב מעריכית של הצמיחה תשואות חלבון יותר משמעותית9. השפעת צפיפות אופטית שנצפו על התא גולמי תמצית ביצועים עקביים באלה. שדווחו עבור מערכות אחרות ללא תא הביטוי נגזר מן התאים גדלו ב אצווה תרבות תנאים1. כי נ’ natriegens גדל בקצב מהיר, חיוני לעקוב מקרוב אחר צפיפות אופטית של תרבויות. באופן כללי, הוא צפוי כי נ’ natriegens תרבויות צריך להגיע reproducibly של יתר600 של 1.0 בתוך h 1−1.5 באמצעות פרוטוקול זה; עם זאת, תנאי הגידול בודדים כגון השימוש של התפישה לעומת מבחנות התפישה, אשר משפיעה על אוורור או באוויר לעומת מים דגירה, אשר משפיע על קצב ועל היציבות בטמפרטורת דגירה, עשוי לשנות זמן צמיחה. יתר על כן, מומלץ בדרך כלל על תרבות לפחות 250 מ של נ’ natriegens בבקבוקון במבוכה 1 ליטר כדי להבטיח גלולה תא גדול-הקציר עבור טיפול קל והעברה. זה משפר באופן משמעותי את ההצלחה של הכנת תמצית תא גולמי, כמו גם מגביר הנפח הכולל של תמצית המופקת גלולה. בעת שימוש הכנה בקנה מידה קטן יותר, תרבות ותנאים ריאגנטים ניתן להתאים בהתאם. החימוץ בקנה מידה גדול, נוספים מיטוב של תרבות תנאים עשוי להידרש. לבסוף, כדי להבטיח תשואה חלבון גבוהה, זה קריטי כי כדורי תא יעובדו מיד לאחר הקטיף, או בתוך ימי 1−2 אחסון ב- 80 ° c

פירוק תקין של בגדר תא על-ידי sonication הדופק הוא קריטי להצלחה של ביטוי חלבון נטול תאים, והוא לעיתים קרובות ההיבט הקשה ביותר של פרוטוקול זה עבור משתמשים חדשים. בדרך כלל, גלולה טוב lysed תניב נפח משמעותי של תמצית נוזלית ללא תשלום של פסולת. התמצית צריך להיות מעט צמיגה, אבל יכול להיות בקלות pipetted כאשר aliquoting לאיחסון צינורות לפני פלאש קפוא חנקן נוזלי. איור 3 מתאר ייצוג של גלולה טוב lysed (איור 3 א) בהשוואה גלולה לקוי lysed (איור 3B) לאחר השלב צנטריפוגה פירוק פוסט. סימן העיקריים של פירוק התא המלא הוא תא גולמי תמצית חלבון הכולל ריכוז > 20 מ”ג / מ”ל כפי שנקבע על ידי וזמינותו חלבון הכולל (שלב 2.13). Sonication יתר או חימום יתר של התמצית תא גולמי יגרום נזק המכונות הסלולר, אשר לא ניתן לקבוע ללא ביצוע תגובה ללא תא. לכן, זה מאוד מועיל לבחון את יעילות תמצית עם תגובת שליטה לפני מקדישה זמן ניכר ומאמץ ליישומים ביטוי חלבון במורד הזרם. בעוד נוספים מיטוב עשוי להיות נחוץ עבור ציוד sonication שונים, הדופק sonication השלבים המתוארים היו מאוד לשחזור בידיים שלנו.

השימוש של תבנית ה-DNA ליניארי נגזר הגברה PCR, תקציר אנזים הגבלה או הגן המסחרי סינתזה עלולים להגדיל באופן משמעותי את יכולת ייצור החלבון תפוקה גבוהה ומהירה ללא תא ביטוי מערכות24. ייצור החלבון מתבנית ליניארי מוגבר PCR הוכח, התשואה של תגובות אלו הן כ 13.5-fold נמוכה יותר בהשוואה תגובות באמצעות פלסמיד תבנית ה-DNA יחסי equimolar9. זאת בעיקר בשל חוסר היציבות של תבנית ה-DNA ליניארי אשר צפוי מושפל נוכח נ’ natriegens תא גולמי תמצית אנדוגני nucleases. בזמן phage למדא חלבון GamS שימש בעבר כדי להגן על ה-DNA ליניארי תבנית24,25, התברר להיות בקנה אחד עם נ’ natriegens תמציות9. בנוסף, בעוד הגדלת הריכוז של תבנית ה-DNA ליניארי עשוי לאפשר תשואה גבוהה יותר של חלבון, והשפלות שלו מהר תא גולמי תמצית עדיין תהיה בעיה רצינית.

פתרון להתגברות על השפלה תבנית ה-DNA ליניארי ייתכן להשלמת התא ללא תגובות עם תבנית ה-mRNA המופקים במבחנה שעתוק של ה-DNA ליניארי. מצד שני, השימוש מעכב RNase מציע הגנה משמעותית נגד mRNA התעתיק השפלה, ניתן להשיג תשואות חלבון ניכר בתבנית התגובה ללא תא 10 μL (איור 5 אב’). שכפול ה-DNA ליניארי לתוך תבנית מעגלית דרך ת א מצדו, טופוגרפיה שיבוט, שער הזהב ההרכבה או בשיטות אחרות רקומבינציה עשוי לשמש כדי לעקוף תבנית השפלה. ובכל זאת, עוד יותר גישות עבור עיכוב של פעילות נוקלאז יהיה צורך עבור ביטוי חלבון יעיל באמצעות תבנית ה-DNA ליניארי.

עד כה, הוצעו מספר גישות שונות עבור הכנה של תמצית גולמי חלבון נטול תא ביטוי9,10,11,26. פיתוח פרוטוקול זה, אנחנו ביקשו להגדיל את נגישות המשתמש, להפחית את העלות הכוללת, ולצמצם את זמן רב שלבים. לדוגמה, תשואה חלבון גבוהה מושגת באמצעות תהליך בן שני שלבים פשוטים sonication-צנטריפוגה, אינה דורשת תא לטקס, צעדים דיאליזה ארוך או מי נגר ולמפולות התגובה. היא פשוט לביצוע תוך תקופה קצרה של זמן, לא דורשת רמה גבוהה של מומחיות מעבדה. לכן, זה יכול לעזור להקל על התא ללא ביטוי כתקן עבור מחקר אקדמי translational ועיצוב תהליך תעשייתי.

פרוטוקול זה מרחיב את ערכת הכלים הזמינים עבור חקירה, התועלת של נ’ natriegens, אורגניזם שאינו-דגם עם תכונות ביולוגיות ייחודיות. תשואה גבוהה יותר של חלבון יכולה להיות מושגת על ידי העסקת חצי או מלא-רציף לחלוטין נטול תא תגובות, כדי לאפשר התחדשות האנרגיה, resupplying של חומצות אמינו, ואת סילוק הפסולת-3,–5,–27. יתר על כן, ההנדסה של פראי-סוג נ’ natriegens כדי לייצר זנים DNAse או RNAse-לקויה, הסרה של מסלולים מטבוליים ברישול, מתחרים, וביטוי של tRNAs נוספים יכול מאוד לשפר את הייצור של חלבונים ב- זה28,מערכת29. ככל שנחשוף את הביולוגיה שבבסיס הצמיחה המהירה שלה, להמשך פיתוח מערכות נ’ natriegens נטולת תא עשוי להאיץ bioproduction יכולות ולאפשר ביטוי חזקים של פפטידים טיפולית, מולקולות קטנות סינתטיים חומרים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומן על ידי לאומי כללי לרפואה למדעי 1U01GM110714-01-המחלקה של אנרגיה דה-FG02-02ER63445. המחברים רוצה להודות ד ר ריצ’רד Kohman, ד ר ג’ני Tam ו ד ר אדגר Goluch. עצות מועילות לגבי בניית המקטע פרוטוקול של כתב היד הזה.

Materials

15 mL Tubes Corning 352196
2 mL Tubes Eppendorf 22363352
384-well Black Assay Plates Corning 3544
384-well PCR Plates Eppendorf 951020702
50 mL Tubes Corning 352070
96-well PCR Plates Eppendorf 30129300
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate Sigma A6885
Adenosine 5'-triphosphate – 100 mM NEB N0450L
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler ThermoFisher 4388444
Assay Plate Adhesives BioRad MSB1001
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) Sigma/Roche 10127965001
Coenzyme A hydrate Sigma C4283
Cytidine 5'-triphosphate – 100 mM NEB N0450L
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) Sigma P8877
Dewar Flask – 4L ThermoScientific 10-194-100C
DL-Dithiothreitol solution – 1 M Sigma 42816
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma 47612
Glacial Acetic Acid Sigma A6283
Guanosine 5'-triphosphate – 100 mM NEB N0450L
HEPES Sigma H3375
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate Sigma 49605
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma G1149
LB Broth (Miller) Sigma L3522
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Plasmid pJL1-sfGFP Addgene 69496
Plasmid Plus Maxi kit Qiagen 12963
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 Sigma 89510
Potassium chloride (KCl) Sigma P9333
Potassium hydroxide Pellets Sigma/Roche 1050121000
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ⅛-inch tip Qsonica 4422
RNA Clean and Concentrator Kit Zymo R1013
RNase Inhibitor, Murine NEB M0314
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride (NaCl) Sigma S7653
Spermidine Sigma S0266
T7 RNA Polymerase NEB M0251
Tris Solution (pH 8.0) – 1 M Invitrogen AM9856
tRNA from E. coli MRE 600 Sigma/Roche 10109541001
Uridine 5'-triphosphate – 100 mM NEB N0450L
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock ATCC 14048
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  2. Schoborg, J. A., et al. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  3. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  4. Henrich, E., Hein, C., Dötsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
  5. Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. Establishing a high yielding streptomyces‐based cell‐free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
  6. Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL–a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678 (2017).
  7. Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements. Synthetic Biology. 3 (1), ysy003 (2018).
  8. Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements. Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).
  9. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System. ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).
  10. Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).
  11. Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens. Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).
  12. Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).
  13. Eagon, R. G. Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes. Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).
  14. Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology. Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).
  15. Lee, H. H., et al. Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse. bioRxiv. , 058487 (2016).
  16. Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. Recombineering in Vibrio natriegens. bioRxiv. , 130088 (2017).
  17. Schleicher, L., et al. Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes. Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).
  18. Fernández-Llamosas, H., Castro, L., Blázquez, M. L., Díaz, E., Carmona, M. Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory. Scientific Reports. 7 (1), 16046 (2017).
  19. Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).
  20. Hoffart, E., et al. High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology. Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).
  21. Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis. Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).
  22. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
  23. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  24. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  25. Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation. Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 16524 (2017).
  27. Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors. Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).
  28. Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).
  29. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).

Tags

Cell-free Protein ExpressionVibrio NatriegensCrude ExtractSonication-centrifugationBioproductionSynthetic BiologyLB-V2 MediaOD 600S30 Lysis BufferSonication

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (145), e59495, doi:10.3791/59495 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image