JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Verwerking van bronchoalveolaire lavage vloeistof en geëvenaard bloed voor alveolaar macrofaag en CD4+ T-cel Immunophenotypering en HIV-reservoir beoordeling

Published: June 23, 2019
doi:
10.3791/59427
, , , , , , , ,
1Research Institute McGill University Health Centre, 2Department of Biological Sciences,Université de Québec à Montréal, 3Department of Microbiology & Immunology,McGill University, 4Department of Medicine, Division of Infectious Diseases,McGill University, 5Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal, 6Département de microbiologie, infectiologie et immunologie,Université de Montréal

Summary

We beschrijven een methode voor de verwerking van bronchoalveolaire spoeling vloeistof en matched perifeer bloed van chronisch HIV-geïnfecteerde individuen op antiretrovirale therapie om pulmonale HIV-reservoirs te beoordelen. Deze methoden resulteren in de verwerving van zeer zuivere CD4 T-cellen en alveolaire macrofagen die vervolgens kunnen worden gebruikt voor immunophenotypering en HIV-DNA/RNA-quantificaties door ultragevoelige polymerase-kettingreactie.

Abstract

Bronchoscopie is een medische procedure waarbij normale zoutoplossing wordt geïnjecteerd in de longen via een bronchoscoop en vervolgens zuigkracht wordt toegepast, verwijderen van bronchoalveolaire spoeling (bal) vloeistof. De BAL vloeistof is rijk aan cellen en kan dus een ‘ snapshot ‘ van het pulmonale immuunmilieu bieden. CD4 T-cellen zijn de best gekarakteriseerde HIV-reservoirs, terwijl er sterk bewijs is dat weefsel macrofagen, waaronder alveolaire macrofagen (AMs), ook dienen als virale reservoirs. Er is echter nog veel onbekend over de rol van AMs in de context van de oprichting en het onderhoud van het HIV-reservoir. Daarom is het ontwikkelen van een protocol voor de verwerking van BAL vloeistof om cellen te verkrijgen die kunnen worden gebruikt in virologische en immunologische testen om de celpopulaties en deelverzamelingen binnen de longen te karakteriseren en te evalueren relevant voor het begrijpen van de rol van de longen als HIV Reservoirs. Hierin beschrijven we een dergelijk protocol, met standaardtechnieken zoals eenvoudige centrifugeren en Flowcytometrie. De CD4 T-cellen en AMs kunnen vervolgens worden gebruikt voor volgende toepassingen, waaronder immunophenotypering en HIV-DNA en RNA-kwantificering.

Introduction

Een van de belangrijkste uitdagingen voor een remedie tegen HIV-infectie is de aanwezigheid van het latente HIV-reservoir, dat een opleving van de plasma viremie veroorzaakt na de onderbreking van de antiretrovirale therapie (art)1,2. Terwijl het HIV-reservoir tijdens lange termijn kunst goed is gedocumenteerd in verschillende weefsel compartimenten, waaronder secundaire lymfoïde organen, gut-geassocieerde lymfoïde weefsel (GALT), en het centrale zenuwstelsel (CNS), zijn de longen over het hoofd gezien als een studiegebied Sinds de pre-ART tijdperk3. De longen spelen echter een centrale rol in de pathogenese van HIV. Pulmonale symptomen behoorden immers tot de eerste indicatoren van aan AIDS gerelateerde opportunistische infecties4. Zelfs in de moderne kunst tijd lopen personen met HIV een groter risico op het ontwikkelen van zowel infectieuze als niet-infectieuze longziekten dan personen zonder HIV. Bijvoorbeeld, personen met een HIV-infectie zijn verhoogd risico op invasieve streptokokken pneumoniae infectie, evenals chronische obstructieve longziekte (COPD)5,6. Bovendien is coinfectie van tuberculose (TBC) en HIV een belangrijke volksgezondheids uitdaging in bepaalde regio’s van de wereld, met name Afrika ten zuiden van de Sahara, omdat HIV-geïnfecteerde individuen 16 tot 27 keer meer kans hebben om TB te hebben dan personen zonder HIV7. Hoewel sommige verklaringen voor deze gevoeligheid voor longinfectie en chronische ziekte zijn voorgesteld8,9,10, de precieze cellulaire mechanismen waarmee individuen met onderdrukt HIV Plasma-virale belasting blijft een hoger risico voor pulmonale complicaties zijn niet volledig opgehelderd. Belangrijk is dat HIV een zeer sterke risicofactor is voor longinfectie en chronische ziekte, onafhankelijk van de rook status6.

Analyse van het immuunsysteem van de longen is daarom cruciaal om zijn rol in gezondheid en ziekte te begrijpen. Hoewel niet-invasieve, geïnduceerde sputum monsters hebben de neiging om grote hoeveelheden epitheelcellen en puin met zeldzame pulmonaire lymfocyten en geen AMs bevatten, hun rol te beperken tot specifieke toepassingen. Omgekeerd kunnen grote biopsieën van weefsel niet worden verkregen bij afwezigheid van vermoedelijke ziekte als gevolg van de bijbehorende Risico’s van significante bloedingen en pneumothorax (ineenstorting van de longen). Bovendien, de meerderheid van de pulmonale immuuncellen zijn voornamelijk gelegen op het mucosale niveau waar de longen voortdurend worden gestimuleerd door antigenen tijdens de ademhaling. Daartoe heeft bronchoscopie om BAL vloeistof te verkrijgen het voordeel dat het relatief veilige toegang biedt tot lymfocyten en AMs (Zie Figuur 1). Macrofagen vormen het grootste deel van de cellen binnen de BAL vloeistof, gevolgd door lymfocyten11. Het is daarom nuttig om een methode vast te stellen waarmee BAL vocht kan worden verwerkt voor gebruik in volgende toepassingen, zoals immunophenotypering, celkweek, transcriptomics of andere toepassingen. Het protocol voor de verwerking van de BAL vloeistof die hier wordt geschetst, is aangepast aan de algemene procedures die eerder zijn beschreven en geoptimaliseerd voor de verschillende downstream assays die worden gebruikt. Deze methodologie zorgt voor de isolatie van zowel pulmonale lymfoïde als myeloïde mucosale immuuncellen voor hun fenotypische en functionele karakterisering, evenals een beoordeling van het HIV-reservoir bij volwassenen die met HIV leven.

Om dit protocol vast te stellen, gebruikten we de volgende criteria om deelnemers aan de studie15aan te werven. Voordeel nemers om in aanmerking te komen voor deelname aan deze studie, moesten zij HIV-geïnfecteerde personen zijn die aan de volgende criteria voldeden: (1) op de kunst gedurende ten minste 3 jaar; (2) onderdrukte virale belasting (VL) gedurende minimaal 3 jaar; (3) CD4 T-celtelling van ≥ 200/mm3; (4) bereid om onderzoek te ondergaan spirometrie en bronchoscopie. Patiënten met de volgende criteria werden uitgesloten van de studie: (1) contra-indicatie (en) voor bronchoscopie; (2) hoog bloedingsrisico: coagulopathie of warfarine of behandeling met Clopidogrel; (3) trombocytopenie (lage bloedplaatjes); (4) actieve longinfectie of een ander acuut pulmonisch proces; (5) zwanger is/probeert zwanger te worden.

Protocol

Dit onderzoeksprotocol werd rechtstreeks vastgesteld op basis van de beginselen die zijn opgenomen in de verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de institutionele beoordelings raden van het McGill University Health Centre (RI-MUHC, #15-031), de Université du Québec à Montréal (UQAM, #602) en het Centre de recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal (CR-CHUM, #15-180). 1. bronchoalveolaire spoeling Opmerking: Deze sectie beschrijft bronchoscopie zoals uitgevoerd door een gelicentieerde respiroloog met hulp van een respiratoire therapeut16,17. Bereid de stukken van het apparaat nodig voor de procedure, met inbegrip van een bronchoscoop en zoutoplossing. Dien anestheticum spray toe aan de achterkant van de keel van de patiënt. Vermijd overmatig gebruik van lokale anesthesie indien mogelijk. Breng cardiale leads aan op de borst om de hartslag en het ritme en een zuurstofsonde op de eerste vinger van een hand te bewaken om de zuurstofverzadiging te bewaken. Plaats de neuscanule in de neusgaten om extra zuurstof te leveren. Plaats de patiënt, bij voorkeur in rugligging. Dien sedatie als volgt toe: midazolam 0,01-0,04 mg/kg en fentanyl 50-100 μg (om het comfort van de patiënt te vergemakkelijken en hoest reflex te minimaliseren), in aanwezigheid van een respiroloog of anesthesist. Pas de flexibele bronchoscoop aan totdat deze in de gewenste subsegmentale bronchus is geklemd. Instill zoutoplossing (50-60 mL in een tijd) met de spuit en breng vervolgens zachte zuigkracht (50-80 mmHg). De spoeling vloeistof wordt in de spuit verzameld en vervolgens overgebracht naar een opvangbakje. Herhaal de spoeling tot een totaal van 200-300 mL lavage. Verzamel indien mogelijk minstens 100 mL BAL vloeistof. Plaats de BAL vloeistof op ijs. 2. isolatie van BAL cellen Opmerking: De volgende procedure moet worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een biologische veiligheidskast, klasse II (BSL2) of hoger. Houd de BAL monsters op ijs totdat ze worden verwerkt. Vortex de BAL in de oorspronkelijke opvang buis en breng deze over in een buis van 50 mL met behulp van een serologische pipet. Als de BAL vloeistof zeer troebel of verontreinigd is door filamenteus weefsel, filtreer de vloeistof door een 70 μm nylon mesh filter in een nieuwe 50 mL buis. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Breng de supernatant over naar een nieuwe tube van 50 mL. Breek de pellet voorzichtig met een pipetpunt en breng het opnieuw in 1 mL RPMI 1640 medium. Breng 1 mL van het supernatant over in elk van de 10x 1,5 mL micro centrifugebuizen en de resterende supernatant naar 15 mL tubes, 10 mL in elk. Bewaar alle supernatant tubes bij-80 °C. Verwerk de BAL celpellet. Rebreng de pellet in 10 mL RPMI 1640 voor elke 25 mL van het originele monster. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Breng de supernatant over naar een nieuwe 15 mL Tube (gooi deze weg nadat er voldoende cellen in de pellet zitten). Respendeer de pellet in 1 mL RPMI 1640 + 10% foetaal runderserum (FBS) en Tel met behulp van trypan Blue en een hemocytometer.Opmerking: Als de BAL vloeistof niet wordt gescheiden door de hechting van cellen vóór het sorteren, ga dan naar sectie 4. 3. hechting van BAL cellen (facultatief) Opmerking: Dit alternatieve protocol kan worden uitgevoerd vóór of in plaats van celsortering. De volgende procedure moet worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een BSL2 kast (of hoger). Breng het gewenste aantal BAL cellen om te sorteren naar een nieuwe 15 mL buis en het juiste volume voor 1,5 x 106 macrofagen/ml. Plaat 2 mL cellen per goed in 6-well platen en inincuberen voor 2 h bij 37 ° c met 5% CO2, om tijd te geven voor hechting. Na incubatie, de media met niet-aanhandende cellen voorzichtig aspireren en overbrengen naar een buis van 15 mL. Centrifugeer op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Verwijder het supernatant en hervat het met 1 x 107 cellen/ml in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 2% FBS en breng de suspensie over in een polystyreen buis van 5 ml met ronde bodem. Deze lymfocyten fractie is nu klaar om te vlekken voor het sorteren van cellen. Aan de overgebleven heers in de plaat, voeg 1 mL per put van de cel-disassociation oplossing (Zie de tabel van de materialen) en incuberen gedurende ten minste 15 min bij 37 ° c met 5% Co2, totdat de cellen gemakkelijk scheiden van de plaat met een pipetpunt. Wrijf de aanhandige cellen voorzichtig, maar grondig af vanaf het oppervlak met behulp van een pipetpunt, en gebruik 1 mL vloeistof in de put om te helpen bij het detachement. Breng de cellen over naar een nieuwe tube van 15 mL. Was de putjes met 1 mL PBS en voeg deze toe aan dezelfde buis. Maak de inhoud van de buis tot 5 mL met PBS. Centrifugeer op 300 x g gedurende 10 min bij RT. Verwijder het supernatant, hervat het met 1 x 107 cellen/ml PBS + 2% FBS en breng de suspensie over in een polystyreen buis van 5 ml met ronde bodem. Deze myeloïde fractie is nu klaar om te vlekken voor het sorteren van cellen. 4. isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen Opmerking: De volgende procedure moet worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een BSL2 kast (of hoger). Op dezelfde dag van de bronchoscopie (in het algemeen direct voor de BAL-collectie), verkrijgen zes buisjes van veneuze bloed van een donor in ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) buizen (ongeveer 10 mL per buis). Scheid het bloed door de bloedbuizen te centrifugeren bij 300 x g gedurende 15 minuten bij RT. Breng de plasma naar 1,5 ml micro centrifugebuizen in 1 ml aliquots en bewaar het bij-80 °c. De scheiding van dichtheids overgangen uitvoeren. Voeg 2 mL RPMI 1640 toe aan elke bloed buis en meng goed met behulp van een serologische pipet. Breng op 3 50 mL buizen en maak het volume in elke buis tot 25 mL met RPMI 1640. Maak een andere batch van 3x 50 mL tubes, elk met 20 mL lymfocyten scheidings medium (LSM) (Zie de tabel met materialen) bij RT. laag de 25 ml verdund bloed bovenop de LSM voor elk van de drie buisjes langzaam en zachtjes, waarbij de buis in een hoek van 45 ° wordt gehouden . Centrifugeer bij 600 x g gedurende 25 minuten bij RT met lage acceleratie en geen vertraging (rem uit). Het wassen van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) uitvoeren. Breng de laag van cellen op de interface van de twee vloeibare fasen in de buis naar een buis van 50 mL met behulp van een serologische pipet; Als er meer dan 30 mL volume is, verdeel het dan in twee buisjes. Maak het volume in elke buis tot 50 mL met PBS. Centrifugeer op 700 x g gedurende 5 minuten bij RT en Verwijder zo veel mogelijk supernatant. Respendeer de pellet en maak het volume op 25 mL met PBS. Centrifugeer bij RT 350 x g gedurende 10 minuten en Verwijder zo veel mogelijk supernatant. Herhaal de in stap 4.4.3 beschreven wasstap. Rebreng de pellet in 5 mL PBS + 2% FBS en Tel de cellen. 5. Sorteer hele BAL cellen en PBMCs Opmerking: De volgende procedure moet worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een BSL2 (of hoger). Maak een sorteer buffer met PBS + 5% FBS + 25 mM HEPES (pH 7,4). Bereid polystyreen buisjes met ronde bodem van 5 mL met 1 mL FBS voor de verzameling van gesorteerde celsubgroepen. Voer vlekken uit. Maak 3x 5 mL rond bodem polystyreen buisjes, elk voor BAL (hele cellen of lymfocyten en myeloïde fracties na hechting) en PBMCs (zie rubriek 4). Voor elke subset, bereid een buis met cellen te sorteren en twee buizen van 5 x 105 cellen te gebruiken voor onbevlekt en levensvatbaarheid vlek compensatie controles. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Verwijder de supernatants, hervat de cellen voor besturingselementen in 100 μL PBS en bewaar ze bij 4 °C totdat de compensatie controles kunnen worden voorbereid zoals beschreven in stap 5.2.6. Maak een 1:20 verdunning van de FC receptor (FcR) blokkerende reagens in PBS + 5% FBS (Zie de tabel met materialen-om te voorkomen dat de niet-specifieke binding van antilichamen aan FCR op FCR-uitdrukken cellen). Respendeer de cellen om ze te sorteren op 1 x 107 cellen in 250 ΜL FCR-blokkerende mengsel. Inbroed ze gedurende 1 uur bij 4 °C. Voeg na incubatie de juiste antilichaam cocktail (Zie tabel 1) toe aan de cellen en incuberen gedurende 1 uur bij 4 °c in het donker. Voeg na 1 uur kleuring 1 mL PBS toe aan de cellen en centrifugeer op 350 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Verwijder de supernatant-en respendeer cellen in de sorteer buffer om 1 x 107 cellen in 250 μL te hebben. Filtreer indien nodig de cellen door een filter van 70 μm. Compensatie controles voorbereiden. Voeg drie druppels toe met elk anti-muis IG-, κ-en negatieve-controle compensatie kralen (Zie de tabel met materialen) per 1 ml PBS in een micro centrifugebuis en breng 100 μL over in elk 5 ml rond-bodem polystyreen buisje om te worden gebruikt voor compensatie. Bereid één buis voor elk fluorochrome aanwezig in de cocktail te gebruiken. Voeg 1 μL van elk antilichaam in de cocktail toe aan een andere buis met kralen. Voeg 1 μL levensvatbaarheid vlek toe aan een van de buisjes van 5 x 105 cellen die in stap 5.2.1 opzij zijn gezet. Inincuberen gedurende 20 minuten bij 4 °C in het donker. Voeg 1 mL PBS toe aan elke buis en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 350 x g . Verwijder de supernatant en rebreng de pellet in 250 μL PBS. Bewaren bij 4 °C in het donker totdat het nodig is. Sorteer de cellen met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) in Verzamel buisjes bereid met 1 mL FBS en draai zachtjes om de zijkanten van de buizen met serum te kapen. Sorteer BAL cellen bij lage druk. Gate cellen eerst ruis uitsluiten en omvatten levende, CD45+ cellen, en binnen deze populatie Gate uit Doublet cellen (Zie Figuur 3). Binnen de grotere myeloïde populatie sorteren CD206 en CD169 dubbele positieve cellen als AMs; binnen de kleinere lymfocyten populatie isoleren CD3+ cellen en sorteren zowel CD4-als CD8 enkelvoudige positieve populaties (Zie Figuur 3; gating strategie beschreven in de representatieve resultaten sectie). Bij het sorteren van PBMCs, poort cellen eerst om ruis uit te sluiten en omvatten levende, CD45+ cellen, en binnen deze populatie Gate uit Doublet cellen. Vervolgens Gate op CD3 cellen en binnen de CD3- populatie, Gate eerst op CD14 en sorteer enkel-positieve monocyten, en vervolgens binnen de CD3+ populatie Gate op CD4 en CD8 en sorteren beide enkelvoudige positieve populaties (gating strategie gedetailleerd in de Sectie representatieve resultaten. 6. immunophenotypering van AMs en PBMCs Opmerking: De volgende procedure moet worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een BSL2 kast (of hoger). Voeg tot 1.000.000 elk van AMs en PBMCs toe aan twee afzonderlijke polystyreen buizen met ronde bodem van 5 mL. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en verwijder het supernatant. Voer FcR-blokkering uit om de specificiteit van de antilichaam kleuring te verbeteren. Breng hiervoor de cellen in 100 μL PBS + 2% FBS en voeg 1,4 μL FcR blokkerende reagens toe. Inincuberen gedurende 20 min bij 4 oC. Extracellulaire kleuring uitvoeren. Na de incubatie met FcR-blok, voeg de gewenste cocktail van het extracellulaire antilichaam toe, Vortex de buizen, en incuberen voor 1 uur bij 4 °C in het donker. Was 2x door toevoeging van 500 μL PBS en centrifugeren bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 °c. Bereid u voor op fixatie en permeisatie (Zie de tabel met materialen voor specifieke gebruikte reagentia). Bereid permeabilization oplossing met 1 deel permeabilization buffer en 3 delen verdunnings vloeistof buffer. Rebreng de pellet in 1 mL permeabilization oplossing en inbroed gedurende 40 minuten bij 4 °C in het donker. Reinigingsoplossing bereiden met 1 deel wasbuffer en 4 delen H2O. Voeg 2 ml wasoplossing toe aan de permeabel cellen en centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Verwijder het supernatant. Intracellulaire kleuring uitvoeren. Respendeer de cellen in 100 μL 1x Wash-oplossing, voeg de gewenste intracellulaire antilichamen toe, Vortex de buizen en inincuberen gedurende ten minste 1 uur bij 4 °C in het donker. Voeg 2 mL wasoplossing toe en centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder de supernatant en rebreng de pellet in 200 μL PBS. Bewaar de cellen op 4 °C in het donker totdat ze nodig zijn. 7. restant van de BAL cellen Opmerking: De volgende procedure moet worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een BSL2 kast (of hoger). Celnummers toestaan, invriezen levende cellen uit de bal cel pellet (uit stap 2.2.2). Maak Vries dragers met 90% FBS + 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Verwijder de supernatant en respendeer in 1,5 mL Vries media in een cryogene injectieflacon. Breng de cryogene injectieflacons over naar een Vries container met gecontroleerde snelheid (Zie de tabel met materialen) en plaats deze op-80 °c. Breng de cellen over naar vloeibare stikstof voor lange termijn opslag zodra de temperatuur is bereikt. Bewaar de BAL cellen als droge pellets. Breng de overblijvende cellen over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Centrifugeer in een tegentopcentrifuge bij 6.000 x g gedurende 1 minuut. Verwijder zo veel mogelijk supernatant zonder de pellet te storen. Bewaar de pellet bij-80 °C. 8. HIV-DNA en RNA-kwantificering Opmerking: De volgende procedure moet worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een BSL2 kast (of hoger). Totale HIV-DNA-kwantificering Om de remming van de polymerase kettingreactie (PCR) met BAL lysaat puin te voorkomen, gebruikt u een DNA-extractie Kit (Zie de tabel met materialen) om DNA uit een monster van bal cellen te halen volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik 15 μL van dit DNA in combinatie met een Mastermix in de voor versterkings stap die hieronder wordt beschreven (stap 8.1.3). Bereiding van de standaard curve verdunningen. Gebruik, zoals hierboven, een DNA-extractie Kit om DNA uit een pellet van 2 x 106 Ach-2-cellen te halen (Zie de tabel met materialen). Na elutie van het DNA voert u seriële 10-voudige verdunningen van het ACH-2-DNA uit om zes verdunningen te genereren, variërend van 3 x 105 cellen tot 3 cellen per 15 μL. Voer een preamplificatie stap uit. Bereid in een aparte ruimte de Master mix voor n + 2 samples, bestaande uit 1x polymerase buffer, 3 mm MgCl2, 300 μM dntps en 2,5 U van Taq DNA polymerase (Zie de tabel met materialen) en 300 nm van elk van de vier primers (Zie stap 8.1.3.2). Voer alle maatregelen uit in drievat putten. Gebruik primers hCD3OUT5 ‘, hCD3OUT3 ‘, ULF1 en UR1 om versterkt DNA van zowel humaan CD3 als HIV te genereren (Zie de sequenties in tabel 2). Houd er rekening mee dat beide genen in dezelfde buis worden voorversterkt. Meng zachtjes en draai de buis naar beneden om een volledige menging te garanderen. Verdeel 35 μL Master Mix per put in een 96-well PCR-plaat en voeg 15 μL standaard-of monster-DNA toe. Het totale reactievolume is 50 μL. Voer de voor versterking (denaturatie bij 95 °C gedurende 8 minuten, gevolgd door 12 cycli van 95 °C gedurende 1 minuut, 55 °C voor 40 s, 72 °C gedurende 1 minuut en rek bij 72 °C gedurende 15 min). Voer real-time PCR uit. Om CD3 en HIV DNA te kwantificeren, bereidt u twee Master mixen voor met 1x PCR reaction Master Mix (Zie de tabel met materialen), 1.250 nm geschikte primers en 100 nm probe. Gebruik primers HCD3IN5 ‘ en HCD3IN3 ‘ en Probe CD3 FamZen om menselijke CD3 in één reactie te kwantificeren, en primers UR2 en LambdaT en Probe UHIV FamZen om HIV-DNA in een andere reactie te kwantificeren (Zie de sequenties in tabel 2). Verdeel 13,6 μL van elke mix in qPCR-aangepaste buisjes. Verdun het preamplificatie-PCR-product op 1:10 in steriel water, DNase, RNase en protease vrij. Voeg voor een totaal reactievolume van 20 μL 6,4 μL van elk verdund monster toe aan 13,6 μL qPCR-mengsel in qPCR-aangepaste buisjes. Voer de real-time PCR uit met behulp van het volgende programma: denaturatie bij 95 °C gedurende 4 minuten en 40 cycli van 95 °C voor 3 sec. en 60 °C gedurende 10 sec. met enkele overname. Extrapoleren het aantal HIV-kopieën en nummercelequivalenten in elke reactie buis van de standaard curven. Bereken het aantal HIV-DNA-kopieën/106 -cellen. HIV-RNA-kwantificering Extract RNA uit een monster van BAL cellen, met behulp van een RNA extraction Kit (Zie de tabel van de materialen) volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik 17 μL van dit RNA in de omgekeerde transcriptie en voor versterkings stap die hieronder worden beschreven (stap 8.2.4). LTR-gag RNA gesynthetiseerd in vitro en nauwkeurig gekwantificeerd wordt standaard gebruikt; het wordt bespiked in gezonde donor RNA-extract voor GUSB normalisatie. Bereid zes seriële 10-voudige verdunningen van deze standaard, overeenkomend met 3 x 105 cellen tot drie kopieën van LTR-gag RNA in 17 μL. Verdeel 17 μL van elke standaard verdunning en elk monster in een 96-put-PCR-plaat en behandel de monsters met DNase (Zie de tabel van de materialen) gedurende 10 minuten bij 25 °c om verontreiniging genomisch DNA te verwijderen. Stop de reactie door 2 μL van 25 mM EDTA toe te voegen en de monsters gedurende 10 min bij 65 °C te inbrotten. Reverse transcriptie (RT) en pre-amplificatie-PCR uitvoeren. Voer deze stap uit met behulp van een One-Step RT-PCR Kit (Zie de tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik primers GUSB forward 1, GUSB reverse 1, UR1, en ULF1 om versterkte cDNA te genereren van zowel Human GUSB als housekeeping gen en LTR-gag HIV RNA (Zie de sequenties in tabel 2). De GUSB-waarden zullen worden gebruikt om de HIV-waarden te normaliseren. Verdeel 31 μL Master Mix per put in dezelfde 96-well PCR-plaat met de DNase-behandelde normen en monsters en meng goed. Het totale reactievolume is 50 μL. Voer de plaat gedurende 16 cycli uit volgens de instructies van de fabrikant, met een gloeien temperatuur van 55 °C. Voer real-time PCR uit. Bereid twee Master mixen met 1x PCR reaction Master Mix (zoals hierboven in stap 8.1.4.1), 1250 nM geschikte primers en 100 nM sonde. Gebruik primers GUSB forward 2, GUSB reverse 2 en Probe GUSB-HEX om GUSB cDNA in één reactie te kwantificeren; gebruik primers UR2, LambdaT, en Probe UHIV FamZen om te kwantificeren HIV cDNA in een andere reactie (Zie de sequenties in tabel 2). Verdeel 13,6 μL van elke Master mix in qPCR-aangepaste buisjes. Verdun de RT preamplificatie PCR-producten 1:10 in steriel water, DNase, RNase en protease vrij en voeg 6,4 μL van elk verdund monster of standaard toe aan de juiste PCR-mix. Het totale reactievolume is 20 μL. Voer de real-time PCR uit met behulp van het volgende programma: denaturatie bij 95 °C gedurende 4 minuten en 40 cycli van 95 °C gedurende 3 sec. en 60 °C gedurende 10 sec. bij één acquisitie (Selecteer het groene kanaal voor FamZen en geel voor HEX).

Representative Results

Bij de meeste niet-rokers wordt BAL vocht ontvangen in een steriele container en is een licht troebele geel-oranje-gekleurde vloeistof. De vloeistof kan Pinker in kleur zijn als de donor tijdens de bronchoscopie endobronchiale biopsieën onderging en er een aantal bloedingen optrad. De vloeistof kan donkerder van kleur zijn als de donor een roker is. Na centrifugeren zal de BAL supernatant bijna helder en licht oranje zijn, terwijl de celpellet in kleur kan variëren van gebroken wit tot zeer donker bruin, afhankelijk van de conditie van het monster en of de donor een roker was of niet. Bij het tellen van het hele bal monster kunnen verschillende celtypen worden gevisualiseerd, waaronder grotere, ronde macrofagen rond 17 μm in diameter en kleinere ronde lymfocyten rond 7,3 μm in diameter18,19 (Zie Figuur 2). Macrofagen worden bij rokers vergroot met ongeveer 40. Het onderscheid tussen de celtypes maakt het mogelijk om de macrofagen en lymfocyten afzonderlijk te tellen. Er kan ook wat puin zichtbaar zijn in het veld, vooral in monsters van rokers. Macrofagen zijn het meest overvloedige celtype in het BAL, dat ongeveer 85% van de cellen in niet-roker20heeft, en ze zijn verrijkt bij rokers, zodat ze bijna exclusief kunnen lijken. De BAL cellen hebben de neiging om te aggregeren, dus ze moeten goed worden gemengd tijdens alle manipulaties. De pellet kan donker lijken, zelfs na verschillende wasstappen. Als filamenteuze resten zichtbaar zijn in de Fractie na kleuring voor het sorteren van cellen, geeft u de cellen door een filter van 70 μm voordat u ze door de celsorteerder voert. Het sorteren van BAL cellen moet bij een lage druk worden gedaan om te zorgen dat de druppel groottes groot genoeg zijn voor de macrofagen. De cellen worden eerst omheind met alle CD45+21 cellen, en vervolgens op basis van de levensvatbaarheid om ervoor te zorgen dat alle dode cellen worden uitgesloten (Zie Figuur 3). Singlet-cellen worden dan gekozen en binnen dit, twee populaties worden afgesloten op basis van grootte en morfologie, namelijk grotere myeloïde cellen en kleinere lymfocyten (Zie Figuur 3). Binnen de grotere cellen, cellen worden omheind op CD20622,23 en CD16922 en de dubbel-positieve cellen worden gesorteerd als AMS, terwijl binnen de kleinere cellen, CD3+ cellen worden gekozen en afgesloten op CD4 en CD8; CD4 single-positieve en CD8 enkel-positieve cellen worden gesorteerd (Zie Figuur 3). De gebruikte markers werden gekozen op basis van eerder beschreven fenotypes van AMs, zoals de mannose receptor CD206, gevonden op phagocytische cellen23, en de sialoadhesine receptor CD16922. Bij het sorteren van de PBMCs worden cellen eerst op voorwaartse en zijverstrooiing gezet, die een homogene lymfocyten populatie moeten vertonen, die allemaal worden genomen, met uitzondering van ruis dicht bij de nulas (gegevens niet weergegeven). De bevolking is omheind op levensvatbaarheid en CD45, en live CD45+ cellen worden gebruikt. Deze populatie wordt vervolgens op CD3 afgesloten; om monocyten te isoleren, wordt de CD3- populatie vervolgens op CD14 afgesloten en worden alle enkelvoudige positieve cellen gesorteerd. Om lymfocyten subgroepen te isoleren, worden de CD3+ cellen afgesloten op CD4 en CD8 en beide enkelvoudige positieve en celpopulaties worden gesorteerd. Figuur 1 : Protocol overzicht. Een schematische weergave van de workflow van het Protocol, met inbegrip van mogelijke downstream toepassingen van de gegenereerde monsters. PBMC = perifere bloed mononucleaire cellen; BAL = bronchoalveolaire spoeling; LSM = scheidings medium voor lymfocyten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2 : Microscoop veld weergave van hele bal vloeistof. Microscoop beelden van (a) een niet-roker en (B) een roker met zichtbare lymfocyten (L), macrofagen (M) en rode bloedcellen (RBC). Vergroting is 1.000 x (10x oculair en 100x lens met olie onderdompeling). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3 : Representatieve gating strategie voor de celsortering van hele bal cellen. Gating strategie gebruikt voor het sorteren van alveolaire macrofagen (AM), CD4, en CD8 T cellen uit hele BAL celmonsters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Monster Antilichaam Fluorochrome Kloon Volume per test (μL) BAL en PBMC Live/Dead APC-H7 – 1 CD45 PE-Cy7 HI30 5 CD3 Alexa700 UCHT1 2 CD4 PE-Cy5 RPA-T4 4 CD8 BV605 SK1 3 Alleen BAL CD206 Pe 19,2 10 CD169 BB515 7-239 5 Alleen PBMC CD14 BV786 M5E2 5 Tabel 1: stromings paneel voor het sorteren van hele BAL cellen en geïsoleerde PBMCs. Doel Stap Naam primer Primer sequentie HIV totaal DNA of HIV LTR-gag RNA Pre-amplificatie PCR UR1 5 ‘-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3 ‘ ULF1 5 ‘-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3 ‘ Real-time PCR UR2 5 ‘-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3 ‘ LambdaT 5 ‘-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3 ‘ UHIV FamZen: 5 ‘-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3 ‘ CD3 DNA Pre-amplificatie PCR HCD3 uit 5 ‘ 5 ‘-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3 ‘ HCD3 uit 3 ‘ 5 ‘-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3 ‘ Real-time PCR HCD3 in 5 ‘ 5 ‘-GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T-3 ‘ HCD 3 in 3 ‘ 5 ‘-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3 ‘ CD3 FamZen: 5 ‘-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3 ‘ GUSB-RNA Pre-amplificatie PCR GUSB forward 1: 5 ‘-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3 ‘ GUSB reverse 1: 5 ‘-GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3 ‘ Real-time PCR GUSB forward 2: 5 ‘-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3 ‘ GUSB reverse 2: 5 ‘-CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3 ‘ GUSB-HEX: 5 ‘-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3 ‘ Tabel 2: primer en sonde sequenties voor HIV DNA en RNA kwantificering.

Discussion

Hierin beschrijven we een methode voor het verwerken van BAL vloeistof om CD4 T-cellen en AMs te verkrijgen, naast matched PBMCs, die kunnen worden bestudeerd om het HIV-reservoir in de longen te onderzoeken. We hebben onlangs gerapporteerd over HIV-DNA-kwantificering in CD4 T-cellen van gematchte perifere bloed-en BAL monsters, en onze groep toonde aan dat HIV 13 keer meer overvloedig is in pulmonale CD4 T-cellen dan in die van perifeer bloed15. De niveaus van HIV-DNA in AMs zijn echter donor-afhankelijk en daarom is er tot nu toe geen consistente correlatie geweest tussen de HIV-DNA-niveaus in de lymfocyten in vergelijking met macrofagen15. De toegang tot deze primaire macrofaag-deelverzamelingen zal echter een essentieel hulpmiddel zijn om deze vraag te ondervragen en een beter begrip te krijgen van de virale belasting in de longen in de context van het HIV-reservoir.

In de pre-ART tijdperk en in verschillende andere studies met behulp van BAL vocht, deelnemers onderging bronchoscopie om een vermoedelijke pathologie diagnosticeren of verkrijgen van een microbiologische diagnose voor respiratoire symptomen3. We waren echter in staat om deelnemers te werven zonder actieve pulmonale symptomen of pathologieën en alle deelnemers ondertekenden een ethisch toestemmingsformulier15. We waren in staat om deelnemers uit ons centrum aan te werven die deelnamen aan andere studies, zoals een spirometrie screening voor obstructieve longziekte24, evenals personen die andere onderzoeksprocedures ondergaan, zoals leukaferese en Colonoscopy. Eerder onderzoek onder mensen die met HIV leven, toonde aan dat altruïsme een belangrijke factor is die de deelname aan onderzoek studies motiverend25. Net als bij veel menselijke specimens, merkten we veel op van persoon tot persoon variabiliteit. Er was geen manier om te “voorspellen” van welke deelnemers we zouden krijgen BAL met goede versus slechte celopbrengsten. In tegenstelling tot perifeer bloed, dat vrij consistente aantallen lymfocyten oplevert, zijn de celaantallen in BAL vloeistof zeer variabel. Injecteren van een groter volume van normale zoutoplossing in de longen (met de hoop op het verkrijgen van een grotere terugkeer van BAL vloeistof) is niet altijd mogelijk als grotere volumes van normale zoutoplossing vaak geassocieerd met meer hoesten en een hoger risico van koorts postbronchoscopie. We merkten dat het gebruik van een kleinere (in plaats van grotere) diameter bronchoscoop de respiroloog in staat stelde om dieper in de bronchiën te komen en vloeistof te verkrijgen die grotere hoeveelheden cellen bevat. Een consistente bevinding was dat tabaks rokers veel grotere verhoudingen van AMs hadden dan lymfocyten binnen hun BAL vocht, wat wordt verwacht als AMs puin en fijnstof verzwelpt. Bovendien hebben we geconstateerd dat BAL vocht van rokers puin bevatte die de gebruikte apparatuur kunnen blokkeren, zoals PCR-machines en Flow-Cytometers. Vergelijkbare problemen kunnen worden waargenomen in gebieden met een hoge vervuiling of personen die vaker aan slechte luchtkwaliteit worden blootgesteld.

Met betrekking tot hun rol bij de oprichting van HIV-reservoirs en virale persistentie is de zuiverheid van CD4 T-cellen en AMs een belangrijke overweging. Om deze reden hebben we ervoor gekozen om fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te gebruiken om zeer zuivere celpopulaties te verkrijgen. Het is ook mogelijk dat de verzamelde BAL vloeistof kan worden verontreinigd met bloed als sommige kleine bloeden wordt verwacht tijdens een bronchoscopie; de aanwezigheid van naïeve B-cellen zou dit aangeven, en cellen kunnen worden gewassen in een rode bloedcel lysisbuffer om dit probleem te omzeilen. Een andere uitdaging met het bestuderen van BAL vocht heeft betrekking op het kwantificeren van inflammatoire markers en cytokines, die belangrijk zijn voor het begrijpen van HIV-persistentie26. Omdat de ingeprent zoutoplossing de bal vloeistof verdunt, kunnen de niveaus van ontstekingsmediatoren en cytokines moeilijk te meten zijn. Hoewel er een ureum correctiefactor is voorgesteld voor verdunning, is er relatief weinig literatuur die het gebruik ervan beschrijft27,28.

AMs zijn zeer autofluorescentie, wat een probleem vormt tijdens het sorteren van cellen en Flowcytometrie fenotypische analyse. In het bijzonder is het effect meer uitgesproken bij rokers wier AMs volledig zwart van kleur kan zijn, wat hun autofluorescentie significant beïnvloedt. Wanneer opgewonden door een standaard blauwe 488 nm-laser, is de am-autofluorescentie op zijn hoogtepunt bij ongeveer 540 nm, dat overlapt met de fluorescentie spectra van veelgebruikte conjugaten zoals FITC en PE29,30. Het is vermeldenswaard dat twee afzonderlijke lasers kunnen worden gebruikt om te prikkelen FITC en PE (bv, PE door de gele/groene en FITC door de blauwe 488 laser). Om de inherente auto fluorescentie met FITC te overwinnen, gebruikten we Onbevlekte AMs om de autofluorescentie-achtergrond te bepalen. Bovendien kan het gebruik van fluorescentie minus één (FMO) besturingselementen zeer nuttig zijn om deze technische problemen te bestrijden. Grotere parels (bijv. 7,5 μm) kunnen worden gebruikt, die dichter bij de grootte zijn voor het compenseren van macrofaag populaties, vergeleken met kleinere kralen (bijv. 3,0 μm), die kunnen worden gebruikt voor het compenseren van lymfocyten populaties. Een nog geschiktere aanpak zou zijn om een kleine fractie van cellen te gebruiken als de enkelvoudige vlek controle, met behulp van een bekende, sterk uitgedrukt marker op de subset, zoals HLA-DR of CD45, geconjugeerd aan elk van de gewenste fluorochromes, die een veel meer nauwkeurige compensatie dan kan worden bereikt met kralen. In het geval van rokers monsters, deze tactiek is vooral nuttig als de macrofagen zijn veel groter en meer autofluorescent. Bovendien, vanaf de voorbereidingsstap, het hele BAL monster kan worden gekweekt in een plaat voor het sorteren zoals beschreven in sectie 3 van het Protocol, om een scheiding van de populaties door de hechting toe te staan. Op deze manier kunnen de aanhandige macrofagen worden geïsoleerd van andere niet-aanhandige cellen zoals lymfocyten. Compensatie is veel minder uitdagend als de lymfocyten en de AM-populaties gescheiden zijn in plaats van samen te worden onderzocht; echter, afhankelijk van de hechting zal resulteren in een verlies van macrofagen, dat is een belangrijke overweging wanneer de celaantallen zijn al beperkend. Ook, een stap van de hechting kan resulteren in de ongewenste activering van de aanhandige monocyten, die van invloed kunnen zijn op de downstream resultaten gegenereerd met behulp van deze cellen. De waarde van het efficiënt sorteren van cellen in zuiverder populaties moet worden afgewogen tegen de beperking van het hebben van minder dergelijke cellen voor latere experimenten.

Andere modellen, met name Murine modellen, zijn gebruikt om macrofaag immunologische kenmerken en biologie te bestuderen. Hoewel deze modellen zeer nuttig zijn en een goed inzicht bieden in een celtype dat moeilijk te manipuleren is, hebben ze beperkingen. Veel van de celoppervlak markeringen variëren tussen muizen en mensen, zodat het aspecten van Human AMS niet volledig wordt begrepen. Dit modelsysteem vereist echter het bundelen van verschillende muizen voor assays vanwege de lage celaantallen die voor elk dier beschikbaar zijn. Bovendien, de noodzaak om specimens te pool zich verzet tegen overwegingen van genetische aanleg en geslacht. Onlangs is gebleken dat seks een rol speelt in de infectiviteit van macrofagen door HIV-1 als gevolg van de heterogene uitdrukking van de beperkings factor SAMHD-131. Nonhuman primaten (NHP) vertegenwoordigen het dichtst bij de mens liggende model en vergemakkelijkt de studie van de infectie van het Simian immunodeficiëntie virus (SIV) en het effect ervan op het immuunsysteem, waardoor inzicht wordt verschaft in de rol van weefsel Resident macrofagen in vergelijking met monoyte-afgeleide macrofagen. In rhesus macaques is ook aangetoond dat Long macrofaag isolaten uit bal Harbor een replicatie-competent virus; een virale uitgroei test (VOA) werd gebruikt om het gedrag van SIV in weefsel-Resident cellen32te analyseren. Een dergelijke bevinding is van aanzienlijke onderzoeksinspanningen, maar moet nog steeds worden gevalideerd bij de mens voordat deze kan worden toegepast, en de hoge kosten van het gebruik van Nhp’s verzet zich tegen het gebruik van grote monster populaties. Daarnaast zal Human AMs nuttig zijn voor vele andere toepassingen zoals in vitro virale/microbiële infectie testen en in studies van andere pathogenen zoals tuberculose/HIV-coinfectie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen hun financiers erkennen: de Canadese instituten voor gezondheidsonderzoek (CIHR) (Grant #153082 to CC, MAJ, NC); de Réseau SIDA et maladies infectieuses du fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) die financiering verleende aan CC en MAJ en de McGill University Faculteit der Geneeskunde die financiering aan CC verleende. Deze studie werd ook ondersteund door de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) gefinancierde Canadese HIV Cure Enterprise (CanCURE) team Grant HB2 – 164064 aan MAJ, CC en NC. MAJ houdt de CIHR Canada Research Chair Tier 2 in Immunovirologie en CC en NC houdt een FRQ-S Junior 1 en junior 2 Research Salary Award, respectievelijk. ET is houder van een RI-MUHC studentship MSc Award.

Daarnaast willen de auteurs Josée Girouard en alle klinische medewerkers die betrokken zijn bij het coördineren en verkrijgen van de monsters, evenals de Ademhalings therapeuten, erkennen; Ekaterina Iourtchenko, Hélène Pagé-Veillette, en Marie-Hélène Lacombe op het RI-MUHC Immunophenotyping platform; en Dr. Marianna Orlova voor de levering van de microscopie foto’s. Belangrijker nog, de auteurs willen de vele vrijwilligers bedanken zonder wie dit onderzoek niet mogelijk zou zijn.

Materials

70 µm Sterile Cell Strainer Fisher Scientific 22363548 Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting
ACH-2 Cells NIH 349 HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4
BD FACSAria BD Biosciences N/A Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)
BD LSRFortessa X-20 BD Biosciences N/A  Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)
Bronchoscope Olympus BF-1TH190  EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm
Cell Disassociation Solution Sigma C5914  Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.
CD169  BB515 BD Biosciences 565353 Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry
CD14  BV786 BD Biosciences 563698 Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry
CD206  PE BD Biosciences 555954 Mannose receptor antibody used for flow cytometry
CD3  Alexa700 BD Biosciences 557943 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CD4  PE-Cy5 BD Biosciences 555348 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CD45  PE Cy-7 BD Biosciences 557748 Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry
CD8  BV605 BD Biosciences 564116 T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CompBead Plus BD 560497 Anti-mouse  Ig, κ  and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry
DNase I Invitrogen 18068015 Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA
dNTP Set 100 mM Invitrogen  10297-018 Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D8418  Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells
EDTA Invitrogen AM9912 Used to stop Dnase I enzyme activity
FBS Wisent Bioproducts 080-150 Premium fetal bovine serum to supplement media
FcR Blocking Reagent, Human Miltenyi 130-059-901 Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies
FlowJo v10 FlowJo LLC N/A Flow cytometry analysis software used for all analyses
HLA-DR  BV650 BD Biosciences 564231 MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry
HyClone HEPES solution Fisher Scientific SH3023701 Buffer providing maintenance of physiological pH 
Live/Dead  APC-H7 Invitrogen L34975 Viability marker used for flow cytometry
Lymphocyte Separation Medium (LSM) Wisent Bioproducts 350-000-CL Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood
Mr. Frosty Freezing Container ThermoFisher 5100-0001 Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1°C/minute, the optimal rate for cell preservation
OneComp eBeads Invitrogen 01-1111-41 Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples
PBS 1X Wisent Bioproducts 311-010-CL Phosphate buffered saline for cell washing and staining
PCR Tubes Corbett Rotor-Gene Axygen PCR-0104-C 4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene
PerfeCTa qPCR ToughMix Quantabio 95112 2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates 
QiaAmp DNA Mini Kit Qiagen 51304 Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers
Rotor-Gene Q Qiagen 9001550 Real-time PCR cycler
RPMI 1640 1X Wisent Bioproducts 350-000-CL Cell culture media
Sterile Water Wisent Bioproducts 809-115-CL DNase, RNase & protease free
Superscript™ III One-Step RT-PCR System  Invitrogen 12574018 RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate
Taq DNA Polymerase  Invitrogen 18038-042 Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride
Transcription Factor Buffer Set BD Biosciences 562725 Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer
Trypan Blue Sigma T8154 Viability dye to count cells using haemacytometer 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chun, T. W., Fauci, A. S. Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).
  2. Finzi, D., et al. Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy. Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).
  3. Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection. Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).
  4. Center for Disease Control and Prevention. A cluster of Kaposi’s sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California. Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).
  5. Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus. Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).
  6. Kunisaki, K. M. Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease?. Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).
  7. World Health Organization. . WHO | Tuberculosis and HIV. , (2018).
  8. Jambo, K. C., et al. Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function. Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).
  9. Yeligar, S. M., et al. Dysregulation of Alveolar Macrophage PPARγ, NADPH Oxidases, and TGFβ. AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).
  10. Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages. AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).
  11. Holt, P. G., et al. Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure. Clinical & Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).
  12. Brenchley, J. M., et al. High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage. Mucosal Immunology. 1, 49 (2007).
  13. Mwandumba, H. C., et al. Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection. The Journal of Immunology. 172, 4592 (2004).
  14. Gordon, S. B., et al. Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses. Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).
  15. Costiniuk, C. T., et al. HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy. AIDS. 32, 2279-2289 (2018).
  16. American Thoracic Society. . American Thoracic Society – Bronchoalveolar Lavage. , (2004).
  17. King, T. E. . Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage – UpToDate. , (2018).
  18. Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls. European Respiratory Journal. 50, (2017).
  19. Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50, 243-248 (1985).
  20. Heron, M., et al. Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung. Clinical & Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).
  21. Rheinländer, A., Schraven, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
  22. Yu, Y. R. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).
  23. Geiser, M. Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).
  24. Costiniuk, C. T., et al. Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study. HIV Medicine. , (2019).
  25. Balfour, L., et al. Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173). AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).
  26. Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir. Cytokine & Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).
  27. Rennard, S. I., et al. Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution. Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).
  28. Twigg, H. L., et al. Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects. The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).
  29. Duan, M., et al. Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease. The Journal of Immunology. 189, 946 (2012).
  30. Garn, H. Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).
  31. Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  32. Avalos, C. R., et al. Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).

Tags

Bronchoalveolar Lavage (BAL)Alveolar MacrophagesCD4+ T-cellsHIV ReservoirImmunophenotypingPulmonary Mucosal T-cellsVirologic Assessment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Salahuddin, S., Thomson, E., Méziane, O., Farnos, O., Pagliuzza, A., Chomont, N., Olivenstein, R., Costiniuk, C., Jenabian, M. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. J. Vis. Exp. (148), e59427, doi:10.3791/59427 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image